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重组人组织型纤溶酶原激活剂改构体复性研究
目的研究重组人组织型纤溶酶原激活剂改构体(reteplase)体外复性.方法通过研究复性所需的时间、温度、pH值、蛋白浓度、氧化还原对比例和添加精氨酸等因素,确定了reteplase复性所需的基本条件,并对直接稀释法、氧化复性后再稀释和脉冲稀释法进行了方法学比较研究.结果脉冲稀释法优于直接稀释法和氧化复性后再稀释.结论建立了reteplase复性方法,此方法可使重组蛋白在较高的重折叠浓度下仍具有良好的复性效率.
关键词： 重组人组织型纤溶酶原激活剂改构体 复性 脉冲稀释 -
重组人组织型纤溶酶原激活剂改构体质控方法的建立
目的 建立重组人组织型纤溶酶原激活剂(tissue type plasminogen activator,tPA)改构体(TNK-tPA)的质控方法.方法 采用气泡法测定TNK-tPA原液的生物学活性,非还原SDS-PAGE和RP-HPLC法测定其纯度,还原型SDS-PAGE确定其相对分子质量,HPLC-SEC法测定其单链含量,胰酶裂解法分析其肽图,Edman降解法测定其N-末端氨基酸序列,毛细管等电聚焦电泳法测定其等电点,Lowrry法测定其蛋白质含量,地高辛法测定其外源DNA残留量.按《中国药典》三部(2005版)要求,对TNK-tPA成品进行鉴别试验及外观、pH值、水分含量、无菌、装量、异常毒性等检测.结果 3批TNK-tPA原液的生物学活性为(2.09～2.16)×106 U/ml,比活性均大于3.5×1o5U/mg,因此确定TNK-tPA原液的比活性不得低于3.0×105 U/mg.3批TNK-tPA原液的非还原型SDS-PAGE纯度均大于98.0％,RP-HPLC纯度均大于97.0％；经还原型SDS-PAGE分析可见两条带,相对分子质量分别为68 000和35 000；样品原液的单链含量为75.7％；3批TNK-tPA原液的肽图酶切图谱与理化参考品一致；TNK-tPA原液的N-末端氨基酸序列、等电点、蛋白质含量、外源DNA残留量及成品的鉴别试验结果、外观、pH值、水分含量、无菌、装量、异常毒性等均符合《中国药典》三部(2005版)要求.结论 建立的质控方法可保证产品安全、有效、质量可控,可用于TNK-tPA产品的常规检定.
关键词： 重组人组织型纤溶酶原激活剂改构体 质量控制 生物活性 -
SEC-HPLC法测定rhTNK-tPA单链含量
目的:测定重组人组织型纤溶酶原激活剂改构体(combinant human mutant-threonine mutant-asparagine mutant-lysine tissue type plasminogen activator,rhTNK-tPA)单链含量.方法:将样品用二硫苏糖醇(DTT)打开二硫键,采用分子排阻色谱(size-exclusion high performance liquid chromatograph,SEC-HPLC)法测定.色谱柱:Tsk-Gel2000SWxl;流动相:0.2 mol·L-1PB-0.1％ SDS水溶液;流速:0.5 mL·min-1;检测波长:214 nm;柱温:23℃;检测时间:30 min.结果:试验精密度和重复性良好;分离度不低于1.1;3批rhTNK-tPA原液的单链含量分别为74.41％、75.39％、74.43％,3批成品的单链含量分别为73.82％、74.76％、74.91％.结论:本方法经方法学验证可用于rhTNK-tPA产品的常规检定.
关键词： 重组人组织型纤溶酶原激活剂改构体 高效液相色谱 单链含量
