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PF-4708671和NVP-BEZ235联合用药协同抑制MDA-MB-436和A549细胞增殖
目的 研究p70核糖体S6激酶β-1(S6K1)抑制剂PF-4708671激活蛋白激酶B(AKT)的分子机制,以及其联合磷脂酰肌醇-3-激酶/哺乳动物西罗莫司(雷帕毒素)靶蛋白抑制剂NVP-BEZ235对肿瘤细胞增殖的抑制作用.方法 PF-4708671单独处理人乳腺癌MDA-MB-436和肺癌A549细胞0,1,3,6,12和24 h或与西罗莫司联合处理24 h后,Western蛋白印迹法检测p-S6及p-AKT表达水平;敲低肿瘤细胞中S6K1基因,并用PF-4708671处理野生型和突变型细胞,Western蛋白印迹法检测S6K1及p-AKT473表达水平;PF-4708671和NVP-BEZ235单用及联用于肿瘤细胞,Western蛋白印迹法检测p-S6及p-AKT473的表达水平,同时分别采用平板克隆和CCK8法检测肿瘤细胞增殖和存活.结果 PF-4708671处理肿瘤细胞不同时间后,在抑制S6K1活性的同时增强AKT活性(P<0.01);西罗莫司和PF-4708671都能抑制S6K1活性(P<0.01)并激活AKT,并在联用时进一步增强AKT活性;敲低S6K1基因导致AKT活性增强;PF-4708671处理敲低S6K1基因的突变型细胞,相对于野生型细胞,对AKT活性的激活程度显著减弱(P<0.01);PF-4708671和NVP-BEZ235联用能抑制AKT活性(P<0.01),同时显著降低肿瘤细胞的克隆形成率和增殖活性(P<0.01).结论 PF-4708671通过抑制S6K1活性反馈激活AKT,这可能是导致其对肿瘤细胞增殖抑制作用减弱的原因之一;PF-4708671和NVP-BEZ235联用对肿瘤细胞生长和增殖的抑制作用明显增强.
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缺氧-复氧诱导ECV304细胞与中性粒细胞粘附的分子机制
为探讨缺氧-复氧诱导人脐静脉内皮细胞ECV304与中性粒细胞粘附的信号转导机制,以缺氧-复氧诱导粘附为模型,采用比色法检测粘附率,流式细胞术检测ECV304细胞表面粘附分子E选择素、细胞间粘附分子1的表达,Western blot法检测ECV304细胞亲环素A、磷酸化细胞外信号调节激酶、总细胞外信号调节激酶、磷酸化p70核糖体S6激酶、总p70核糖体S6激酶蛋白的表达.结果发现,经缺氧-复氧处理后,ECV304细胞 E选择素、细胞间粘附分子1的表达上调,其表面中性粒细胞粘附增加.总细胞外信号调节激酶、总p70核糖体S6激酶蛋白表达无明显改变,亲环素A蛋白表达明显上调,细胞外信号调节激酶和p70核糖体S6激酶显著活化.亲环素A抑制剂环孢霉素A以及亲环素A反义寡核苷酸均明显减轻缺氧-复氧诱导的细胞外信号调节激酶和p70核糖体S6激酶激活,显著减少ECV304细胞与中性粒细胞粘附.p70核糖体S6激酶阻断剂雷帕霉素显著抑制p70核糖体S6激酶的激活,中性粒细胞与ECV304细胞的粘附亦明显减少.细胞外信号调节激酶信号通路特异性阻断剂PD98059亦显著抑制ECV304细胞与中性粒细胞粘附.结果提示,亲环素A-细胞外信号调节激酶-p70核糖体S6激酶信号通路介导缺氧-复氧诱导的ECV304细胞与中性粒细胞粘附.
