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表达全人源抗人IgE单抗的候选细胞株鉴定及筛选
目的:鉴定及筛选表达原创性全人源抗人IgE单克隆抗体的候选工程细胞株.方法:对实验室前期筛选到的Mab1#及Mab2#2个候选细胞株的3L摇瓶流加培养12d并经Protein A一步柱层析纯化的抗体样品,进行紫外光谱全波长扫描,采用LC-MS测定精确相对分子质量进行鉴别,采用SDS-PAGE(还原型及非还原型)进行分子完整性分析,采用SEC-HPLC进行集聚倾向性分析,采用IEF进行等电点(pI)测定及对N-糖苷酶(PNGase F)酶切前后样品的电荷进行比较分析,采用CEX-HPLC进行电荷异质性分析.同时,对Mab1#及Mab2#2个候选细胞株的3个月传代稳定性进行比较研究.结果:Mab1#及Mab2#2个候选细胞株表达抗体的紫外大吸收波长均为280 nm;LC-MS轻链相对分子质量分别为23 464.82和23 465.06,重链(G0F糖型)相对分子质量分别为50 807.50 Da和50 807.48 Da,均与理论预期相符;SDS-PAGE(还原型及非还原型)电泳结果显示表达的抗体分子完整性好;SEC-HPLC聚集倾向分析显示2株单抗经一步Protein A亲和柱层析后的可溶性聚合体的含量均小于2％;IEF结果显示Mab1#和Mab2# pI分别为8.38和8.44,PNGaseF酶切前后未见明显的由于糖基化修饰引起的电荷变异体.CEX-HPLC结果显示2株单抗的电荷均一性好,酸性交体及碱性变体含量之和均小于4％.完成的3个月细胞株稳定性研究结果显示Mab1#及Mab2#2株克隆均稳定.结论:Mab1#及Mab2#2个候选细胞株具有相似的目标抗体表达量、表达抗体的质量(分子完整性、聚集倾向、电荷异质性、亲和力)、以及细胞稳定性特征和细胞生长代谢特征等质量属性,均符合制定的阶段筛选目标.
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全人源抗狂犬病病毒单克隆抗体的制备与鉴定
目的:利用人源IgM转基因小鼠制备全人源抗狂犬病病毒单克隆抗体,并对其进行初步鉴定.方法:以灭活的狂犬病病毒CTN株作为抗原免疫人IgM转基因小鼠.采用杂交瘤技术结合酶联免疫吸附试验(ELISA)高通量交叉筛选技术(HTS)制备全人源抗狂犬病病毒单克隆抗体.通过双抗体夹心ELISA鉴定单抗的人源性和抗体型,间接ELISA、斑点杂交(Dot Blot)实验及Western blot检测单抗的特异性,BiaCore X-100测定单抗结合抗原的亲和力.结果:建立了2株稳定分泌抗狂犬病病毒人源性单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为9E3和9F2.双抗体夹心ELISA结果显示2株单抗均为人源性免疫球蛋白IgM型.间接ELISA、斑点杂交实验结果表明2株单抗均能特异性识别灭活的狂犬病病毒CTN株.Western blot结果显示2株单抗均能与狂犬病病毒糖蛋白特异性结合.2株单抗与狂犬病病毒CTN株抗原结合的亲和力分别为2.62×10-10mol/L、4.06×10-11mol/L.结论:筛选制备了2株特异性、高亲和力的全人源抗狂犬病病毒单克隆抗体.本研究为进一步筛选人源抗狂犬病病毒免疫预防性中和抗体及其免疫治疗的应用奠定了基础.
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全人源抗狂犬病病毒糖蛋白抗体的制备及鉴定
目的:利用重组狂犬病病毒糖蛋白(RVG)免疫人源IgM转基因小鼠,制备全人源抗重组RVG蛋白单克隆抗体,并对其免疫学特性进行初步鉴定.方法:以重组RVG蛋白作为抗原免疫人源IgM转基因小鼠,采用杂交瘤技术制备筛选全人源抗重组RVG蛋白杂交瘤细胞株,双抗体夹心ELISA实验鉴定单抗的人源性及抗体类型,并对其特异性及与灭活狂犬病病毒CVS-11株的结合能力进行鉴定.结果:建立了5株稳定分泌抗重组RVG的全人源单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为5D1、6H11、9A3、15D6、19E6,均为人源IgM免疫球蛋白,5株单抗均能特异性识别重组RVG蛋白,其中3株能与灭活狂犬病病毒CVS-11株特异性结合.结论:筛选制备了特异性全人源抗重组RVG蛋白的单克隆抗体,能与灭活狂犬病病毒CVS-11株特异性结合,为进一步研制用于狂犬病防治的抗体药物奠定了基础.
关键词： 人源IgM转基因小鼠 狂犬病病毒糖蛋白 全人源单克隆抗体 -
全人源抗VEGF165单克隆抗体培养工艺的研究
为研究一种表达全人源抗VEGF165单克隆抗体(HVAB)的重组DG44细胞的培养工艺.在摇瓶培养阶段,利用常见的流加和分阶段温度控制培养的方法,初步确定培养工艺.在生物反应器培养阶段,研究了不同pH范围对DG44细胞生长和单克隆抗体表达的影响.结果表明,通过补料可使HVAB表达量从101 mg/L提高到654 mg/L;通过在生长中期的适当降温,使细胞终活性保持在80％以上;pH控制范围6.4～7.4更适合DG44细胞的生长和HVAB表达.反应器中的抗体表达量为526 mg/L,与对照摇瓶相比降低了11％,为之后的中试研究奠定了工艺基础.
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利用五特征转基因小鼠获得的全人源抗VEGF单抗的抑制血管生成及抗肿瘤活性
为研究一种全人源抗VEGF单克隆抗体在体外和体内的抑制血管生成和抗肿瘤活性,利用细胞划痕实验检测抗体抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)迁移的活性；MTT法检测抗体抑制分泌VEGF的肿瘤细胞增殖能力；Annexin V/PI双染检测抗体诱导肿瘤细胞凋亡活性；通过建立胃癌原位模型,静脉注射给予不同剂量的抗体,免疫组化方法检测抗体在体内的抑制血管生成和抗肿瘤活性.结果表明一定剂量的全人源抗VEGF抗体能够显著抑制HUVEC细胞的迁移,明显抑制4种分泌VEGF的肿瘤细胞增殖并显示了一定的诱导肿瘤细胞凋亡的能力.静脉注射一定剂量的抗体能够显著抑制胃癌原位肿瘤的生长和肿瘤血管生成.进而表明该全人源抗VEGF单克隆抗体能够在体外和体内都表现出显著的抑制血管生成和抗肿瘤活性.
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全人源单克隆抗体制备技术的研究进展
1975年,KOHLER等[1]通过杂交瘤技术成功获得了具有抗原特异性的鼠源性单克隆抗体,从而开启了单克隆抗体开发的新纪元.单克隆抗体具有专一性高、亲和力强等特点,已成为多种人类疾病诊断及治疗的重要工具.然而,鼠源性抗体在临床应用方面存在诸多缺陷.鼠源单抗应用至人体时,由于其来源于小鼠,具有免疫源性,会激活人体免疫系统,从而生成人抗鼠抗体,引发免疫损伤;鼠源单抗激活补体和Fc受体相关生物效应系统的特异性存在不足[2].
