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骨形态发生蛋白9基因修饰人羊膜间充质干细胞体外向韧带成纤维细胞分化研究
目的:探讨骨形态发生蛋白9(BMP9)基因修饰对人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)在体外向韧带成纤维细胞(LFs)分化是否有促进作用,并研究其分子机制.方法:体外分离培养hAMSCs及LFs,观察并比较两种细胞形态学差异.经AdMAX系统体外构建BMP9基因腺病毒载体,经提纯及荧光法病毒滴度测定后转染P3代hAMSCs.实验分为三组,A组:携带绿色荧光蛋白(GFP)的空腺病毒载体转染hAMSCs(hAMSCs-GFP);B组:携带BMP9基因的腺病毒载体转染hAMSCs (hAMSCs-BMP9);C组:韧带成纤维细胞组(LFs).于体外分别培养7天后使用荧光定量PCR检测并比较各组韧带相关基因Scleraxis (Scx)、Ⅰ型胶原(Col Ⅰ)、细胞连接素(TNC)、纤维连接蛋白(Fib)及腱调蛋白(Tnmd)mRNA的表达量.使用免疫荧光检测并比较三组细胞体外培养7天后Col Ⅰ的表达量.结果:在倒置相差显微镜下,hAMSCs原代呈多角形贴壁生长,传代后呈长梭状漩涡状生长.LFs原代呈长梭状贴壁生长,传代后呈漩涡状集落样生长.A、B组细胞转染8h、24 h后,生长增殖缓慢,轮廓清晰,细胞形态未发生变化.荧光显微镜观察显示A组在转染8h后可见GFP荧光表达,24 h后表达荧光的数量和强度均增多.实时荧光定量PCR显示,转染7天时B组SCX、Tnmd、Col Ⅰ、Fib及TNC的表达量均高于A组(P＜0.05),而SCX、Fib、TNC及Tnmd的表达量低于C组(P＜0.05),Col Ⅰ的表达量高于C组(P＜0.05).荧光免疫组化显示,转染7天后,B组Col Ⅰ的表达量均高于A组和C组.结论:BMP9基因可促进hAMSCs向LFs定向分化,并促进韧带特异性基因的表达和细胞外基质的产生,为hAMSCs作为韧带组织工程种子细胞提供了实验基础.
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新鲜骨髓吸出物直接种植于支架构建组织工程韧带
背景：有关于应用新鲜骨髓吸出物直接局部注射修复韧带部分损伤的报道，少有提及应用新鲜骨髓吸出物直接种植于支架构建组织工程韧带的研究报道。
目的：评价将新鲜骨髓吸出物直接种植于支架构建组织工程韧带的可行性。
方法：构建丝素纤维/小肠黏膜下层复合支架后，骨髓种植组将骨髓吸出物直接种植于复合支架上；细胞种植组将骨髓间充质干细胞种植于复合支架上；以未接种任何物质的复合支架作为空白对照，检测各组细胞黏附密度、细胞增殖活性及细胞外基质分泌情况。将骨髓种植组复合物植入兔前交叉韧带横断处，12周后取材评价骨髓种植组材料体内生物相容性。
结果与结论：骨髓种植组孵育4 h后的细胞黏附密度、不同时间点细胞增殖率显著高于细胞种植组(P<0.05)。骨髓种植组及细胞种植组Ⅰ型、Ⅲ型胶原分泌量均显著高于空白对照组(P<0.05)，但骨髓种植组及细胞种植组两组间Ⅰ型、Ⅲ型胶原分泌量差异无显著性意义。骨髓种植组材料植入兔体内未引起致死性免疫排斥反应及严重炎症反应，未见明显韧带再生及血管化。说明新鲜骨髓吸出物直接种植于支架可构建组织工程韧带，并且体内短期生物相容性良好。 -
体外诱导人羊膜间充质干细胞向韧带细胞分化的实验研究
目的 探讨人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs)是否具有MSCs 的特性及经诱导后在体外能否向韧带细胞分化.方法 取产妇胎盘通过酶消化法获得hAMSCs,流式细胞术鉴定hAMSCs表型特征.取第3代hAMSCs分别加入含不同诱导液的L-DMEM/F12培养基:A组TGF-β1+bFGF,B组透明质酸(hyaluronic acid,HA),C组TGF-β1+bFGF+HA,D组为空白对照组.倒置相差显微镜观察诱导后21d各组细胞形态学变化;磺酰罗丹明B (sulforhodamine B,SRB)比色法检测各组细胞生长活性;诱导后7、14、21 d分别采用免疫组织化学染色及实时荧光定量PCR检测韧带特异性蛋白和基因Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、肌腱蛋白C(tenascin C,TNC)表达.结果 流式细胞术鉴定结果表明hAMSCs表达MSCs表型.倒置相差显微镜观察示诱导21dA、B、C组细胞均呈长梭形纤维细胞样生长,C组细胞形态更单一、有明显方向性且较A组排列更紧凑.SRB比色法检测示各组细胞于培养6d左右达增殖高峰,6d时A、B、C组细胞活性均显著高于D组.免疫组织化学结果示:诱导培养7d,各组均未检测到TNC表达;7、14、21 dA、B、C组Ⅰ型胶原表达均显著高于D组,14、21 dA、B、C组Ⅲ型胶原表达显著高于D组,差异均有统计学意义(P＜0.001).B组Ⅰ型胶原表达以及A、C组Ⅲ型胶原、TNC表达随时间增加均呈逐渐增高趋势,各时间点间比较差异均有统计学意义(P＜0.001).实时荧光定量PCR结果示:诱导培养21d,C组Ⅰ型胶原、TNC mRNA相对表达量显著高于A、B组,B组Ⅲ型胶原mRNA相对表达量显著高于A、C组,差异均有统计学意义(P＜0.05).A、C组Ⅰ型胶原、TNC以及C组Ⅲ型胶原mRNA相对表达量随时间增加呈逐渐上调趋势,各时间点间比较差异均有统计学意义(P＜0.001).结论 hAMSCs具有MSCs的特性,有良好增殖能力,经体外诱导后韧带特异性基因表达上调,韧带特异性蛋白合成增加,可作为韧带组织工程种子细胞来源之一.
