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BTBD7基因通过作用于 Wnt/β-catenin 信号通路促进人乳腺癌 MCF-7细胞的侵袭转移
目的：观察敲减 BTBD7基因后人乳腺癌 MCF-7细胞的运动侵袭能力的变化,并探讨其作用机制。方法将经慢病毒转染 shRNA,敲减 BTBD7基因表达后的细胞作为实验组(MCF-7-shBTBD7),未进行慢病毒转染的细胞为对照组(MCF-7-vec)。应用划痕愈合实验、Transwell 侵袭实验、MTT 法绘制细胞生长曲线等方法来检测实验组和对照组内 MCF-7细胞的侵袭转移以及增殖能力之间的区别,两组试验结果比较采取独立样本 t 检验。在此基础上通过肿瘤信号通路筛选芯片筛选出 BTBD7作用的下游信号通路,并以 Western blot 实验验证这条信号通路是否确实参与其中发挥作用。结果划痕愈合实验结果显示,与对照组相比,实验组 MCF-7细胞的迁移能力显著降低[24 h 愈合率：(85．95±5．30)%比(43．38±4．01)%, t=18．108, P<0．001]；Transwell 侵袭实验显示实验组和对照组细胞侵袭能力出现明显的差别,与对照组相比,实验组细胞的侵袭能力显著降低(24 h 细胞计数：152±7比50±8,t =27．378, P<0．001)；MTT 实验显示从第4天开始两组细胞增殖能力出现差异,对照组细胞数为(3．17±0．23)×104/ ml,明显高于实验组的细胞数为(2．58±0．21)×104/ ml,差异具有统计学意义(t =3．189, P<0．050)；第7天对照组的细胞数为(9．57±0．36)×104/ ml,仍然显著高于实验组的细胞数(7．29±0．37)×104/ ml,差异具有统计学意义(t=7．654, P<0．050)。通过双荧光素酶检测系统检测肿瘤信号通路筛选芯片的结果表明 Wnt 信号通路的相对荧光强度在两组间差异有统计学意义(t =12．509, P<0．001),Western blot实验结果同样表明,与对照组相比,实验组的 c-Myc、MMP-7以及β-catenin 的蛋白水平均发生变化。结论 BTBD7基因可能通过作用于 Wnt/β-catenin 信号通路促进人乳腺癌 MCF-7细胞的侵袭转移。
关键词： 乳腺肿瘤 同源盒结构域蛋白质类 WNT 蛋白质类 肿瘤侵润 肿瘤转移 -
人 Dickkopf1 基因腺病毒载体的构建及感染黑色素瘤后 β-catenin 表达的研究
目的 构建高表达外源性Dickkopf1(DKK1)基因的重组腺病毒载体(Ad-DKK1);感染黑色素瘤细胞株后研究Wnt信号通路中主要信号分子β-catenin的表达变化. 方法 利用PCR技术扩增目的 基因DKK1;应用分子克隆技术和AdEasy系统重组腺病毒技术,把目的 基因亚克隆到穿梭质粒;经酶切和测序后,在BJAdeasy中同源重组;用PacⅠ酶切过的重组腺病毒DNA在HEK293中包装并扩增;实验分为5组:Ad-DKK1感染组、Ad-SimDKK1感染组、Ad-GFP感染组、Ad-RFP 感染组和空白细胞对照组.按照MOI值为80感染恶性黑色素瘤细胞株A375,观察细胞形态;RT-PCR法检测DKK1、β-catenin基因的表达,MTT法检测细胞活力. 结果 重组腺病毒Ad-DKK1经酶切鉴定与测序证实构建成功.感染A375细胞,感染率均大于80%,感染后细胞形态无明显改变.Ad-DKK1感染组DKK1的表达水平(1.638±0.067)与其他4组(0.718±0.086、1.424±0.125、1.414±0.089、1.423±0.088)比较差异具有统计学意义(P<0.05),其β-catenin的表达水平(0.590±0.011)与其他4组(0.895±0.012,0.749±0.024,0.754±0.012,0.759±0.014)比较差异具有显著统计学意义(P<0.01).MTT法检测细胞活力:Ad-DKK1感染组(0.370±0.014)与其他4组(0.412±0.017、0.398±0.006、0.395±0.007、0.426±0.016)比较差异有统计学意义(P<0.05). 结论 成功构建重组腺病毒Ad-DKK1,经其感染的恶性黑色素瘤细胞中DKK1的表达明显增强,β-catenin的表达显著降低,A375的细胞活力受到抑制.
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IWR-1-endo 对三阴性乳腺癌抑制作用的研究
目的：探明新近发现的 Wnt 信号通路的小分子抑制剂 IWR-1-endo 是否会对三阴性乳腺癌细胞系 MDA-MB-231以及该细胞系的裸鼠荷瘤模型的生长产生抑制作用及其机制。方法应用不同浓度的 IWR-1-endo 处理 MDA-MB-231细胞并计算细胞增殖抑制率。建立裸鼠荷瘤模型并且每2天1次腹腔注射 IWR-1-endo 溶液0.1 mL/10 g,同时每4天1次测量瘤体长径和短径、计算肿瘤体积。4周后,处死小鼠、收集肿瘤组织、测量并计算体积抑瘤率和瘤重抑瘤率。将肿瘤组织制成石蜡切片,进行 Ki-67染色及 TUNEL 染色,以计算增殖指数和凋亡指数。另应用 western blot 检测肿瘤细胞和组织中 Axin 1、Axin 2、β-cate-nin 和 p-β-catenin 蛋白的表达。结果IWR-1-endo 可以明显抑制 MDA-MB-231细胞的生长,其抑制作用呈浓度依赖型,IC50值为180 nmol/L。IWR-1-endo 的体积抑瘤率为42.2%,瘤重抑瘤率为44.6%。与对照组比较,IWR-1-endo 组凋亡指数上升,差异有统计学意义,而增殖指数差异无统计学意义。western blot 检测结果显示细胞及组织中 Axin 1和 Axin 2表达量明显上升,β-catenin 明显下降,而 p-β-catenin 上升。结论IWR-1-endo 可以通过稳定化 Axin 而抑制 Wnt 信号通路,实现对三阴性乳腺癌细胞系及裸鼠荷瘤模型生长的抑制。
关键词： 乳腺肿瘤 WNT 蛋白质类 IWR-1-endo
