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慢病毒介导高表达OTUD7B对乳腺癌MCF-7细胞生物学行为影响
目的 去泛素化酶OTUD7B与肿瘤的发生、发展密切相关.为了明确OTUD7B在乳腺癌中所发挥的作用,实验利用慢病毒构建高表达OTUD7B载体感染MCF-7乳腺癌细胞后对其生物学行为的影响.方法 构建带有绿色荧光蛋白标签的人OTUD7B表达质粒的慢病毒(pEGFP-hOTUD7B)及对照(pEGFP-CI)感染MCF-7乳腺癌细胞;于荧光倒置显微镜下观察病毒转染效果及应用蛋白质印迹法及免疫组化法检测OTUD7B的表达水平;MTS法检测实验组(pEGFP-hOTUD7B)、阴性对照组(pEGFP-CI)和正常对照组对MCF-7乳腺癌细胞增殖能力的影响;应用细胞划痕实验检测细胞迁移能力;流式细胞仪检测细胞凋亡.结果 感染病毒后于荧光倒置显微镜下观察病毒感染效率,可见病毒感染成功.应用蛋白质印迹法检测病毒感染率并找出适病毒感染复数(multiplicity of infection,MOI),当MOI=30时,实验组、阴性对照组和正常对照组灰度值分别为3.81±0.08、2.12±0.078和2.05±0.15,差异有统计学意义,F=402.03,P<0.001.应用免疫组化法可见感染OTUD7B表达水平.MTS法结果显示,实验组、阴性对照组和正常对照组细胞24 h A值分别为0.36±0.08、0.56±0.25和0.69±0.17,F=11.819,P<0.001;48 h A值分别为0.65±0.17、1.45±0.48和1.82±0.63,F=23.752,P<0.001;在72 h A值分别为0.73±0.21、1.58±0.63和1.99±0.27,F=35.563,P<0.001.细胞划痕试验显示,24 h后实验组组迁移率为(7.7±0.91)%,阴性对照组和正常对照组迁移率分别为(13.4±1.52)%和(12.1±1.32)%,F=49.36,P<0.001,48 h后实验组迁移率为(12.4±1.29)%,阴性对照组及正常对照组迁移率分别为(32.9±1.71)%和(31.8±1.59)%,F=504.50,P<0.001.流式细胞仪检测细胞凋亡结果提示,实验组与阴性对照组及正常对照组相比明显使细胞阻滞在G0/G1期,促进其凋亡,FG0/G1期=425.102,FS期=135.063,均P<0.001.结论 成功构建了能够高表达OTUD7B的慢病毒载体,明显抑制了MCF-7乳腺癌细胞增殖、迁移,并促进了其凋亡.
关键词： MCF-7乳腺癌细胞 OTUD7B 慢病毒感染 增殖 迁移 -
OTUD7B在急性髓系白血病细胞中的功能及机制
目的·探讨OTUD7B在急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)细胞中的生物学效应与作用机制.方法·检测AML患者外周血单个核细胞中OTUD7B基因的表达和AML患者骨髓单个核细胞中OTUD7B蛋白的表达.利用TCGA数据库验证OTUD7B与AML患者生存期的关系.构建M2型AML小鼠模型,检测模型小鼠骨髓、脾脏和肝脏中OTUD7B的表达.在白血病细胞株HL60和kasumi1中过表达OTUD7B,检测OTUD7B蛋白对细胞活率及细胞周期的影响;在稳定表达OTUD7B的HL60和kasumi1细胞株中,检测AKT/mTOR通路蛋白的变化;过表达AKT1后检测OTUD7B引起的细胞生长抑制的变化.结果·OTUD7B在各个类型AML患者原代细胞中表达量均较低.OTUD7B表达量与AML患者的生存期密切相关.与野生型小鼠比较,M2型AML小鼠骨髓、肝脏及脾脏中OTUD7B的表达量均较低.HL60和kasumi1细胞中过表达OTUD7B能够显著抑制细胞活率,降低S期细胞的比例,并显著抑制AKT和mTOR蛋白的磷酸化;过表达AKT1后能够部分逆转OTUD7B对细胞的生长抑制作用.结论·OTUD7B在原代AML患者细胞及M2型AML小鼠的骨髓、肝脏和脾脏中低表达,并且OTUD7B表达量低的患者生存期更短.OTUD7B过表达能明显抑制AML细胞HL60和kasumi1的细胞活率,并且显著抑制细胞进入S期.OTUD7B过表达对AML细胞的抑制效应可能与抑制AKT/mTOR信号通路的活化有关.
关键词： OTUD7B 急性髓系白血病 增殖抑制 Akt/mTOR信号通路
