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慢病毒介导hsa-mir-203构建及对K562细胞增殖与凋亡影响观察
目的 运用慢病毒载体系统构建人微小非编码RNA(miR-203)的重组慢病毒载体,并感染人慢性粒细胞白血病细胞(K562),观察其对K562细胞增殖与凋亡的影响.方法 合成miR 203的前体序列,克隆至pLVX-IRES-Zs-Green1载体中构建成重组慢病毒质粒pLVX-shRNA2-miR-203(PremiR-203).经酶切和测序鉴定后,采用脂质体将其与包装质粒PLD2及包膜质粒PLD3共转染293T和K562细胞.荧光显微镜观察293T和K562细胞中绿色荧光蛋白(GFP)的表达.QRT-PCR检测miR-203在K562细胞中的表达水平,MTT实验检测对K562细胞增殖的影响,流式细胞术分析细胞周期,TUNEL染色观察细胞凋亡形态.采用完全随机设计的单因素方差分析组间差异的显著性.结果 经酶切鉴定和核酸序列测定,293T细胞中GFP表达证实成功包装了携带miR-203基因的重组慢病毒,滴度为1.2×108 TU/mL.重组慢病毒感染K562细胞后,细胞中miR-203基因呈高表达;PremiR 203对K562细胞增殖抑制率24 h为(8.10±0.15)％,高于阴性对照组的(5.16±0.14)％,F=3 499.1,P＜0.001;48 h为(32.4±0.49)％,明显高于阴性对照组的(6.4±0.19)％,F=9439.3,P＜0.001;72 h为(59.0±0.53)％,F=32 865.16,P＜0.001.流式细胞术结果显示,细胞周期比例G1期为38％,S期为54％,G2期为8％.荧光显微镜观察到细胞核碎裂、核质固缩、细胞膜突出等典型的凋亡形态.结论 成功构建重组慢病毒介导hsa-miR-203的表达载体,实现了其在细胞中的稳定表达,并有效抑制K562细胞增殖,并促进细胞凋亡.
关键词： hsa-miR-203 人慢性粒细胞白血病细胞 慢病毒 增殖 凋亡 -
Hsa-miR-203联合伊马替尼对慢性粒细胞白血病K562细胞的作用
目的 探讨hsa-miR-203联合甲磺酸伊马替尼(mesylate imatinib MI)对人慢性粒细胞白血病K562细胞的影响.方法 体外培养K562细胞,利用Lipofectamine TM 2000将has-miR-203模拟物转染至K562细胞,MTT法检测使用miR-203、MI以及两者联合使用对细胞增殖的抑制率,流式细胞术检测对细胞早期凋亡率的影响.结果 miR-203转染至K562细胞(24、48、72 h)后,联合MI显著抑制K562细胞增殖,抑制效果较各单独使用组作用明显增强.单用miR-203浓度为50 μmol·L-1时的抑制率分别为19.69%、25.62%、35.21%.而联合不同浓度(0.5、1、2、3、4 μmol·L-1)的伊马替尼,抑制率随着作用时间增加,呈时间-依赖效应.单用hsa-miR-203、伊马替尼及两者联合作用于K562细胞48 h后,早期凋亡率分别为7.8%、8.9%、12.5%.结论 当一定浓度的hsa-miR-203与不同浓度的伊马替尼联合之后,对K562细胞的增殖抑制作用增强,hsa-miR-203提高了K562细胞对伊马替尼的敏感性,其机制可能为共同促进K562细胞早期凋亡有关,并为白血病的治疗提供新的依据.
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miR-203影响K562细胞对三氧化二砷敏感性的研究
目的 探讨has-miR-203与慢性粒细胞白血病三氧化二砷(As2O3)治疗的敏感性的关系及可能的作用机制.方法 体外培养K562细胞,利用LipofectamineTM 2000将miR-203模拟物转染至K562细胞,流式细胞术检测转染效率,MTT法检测使用miR-203,As2O3以及两者联合使用对细胞增殖的抑制率,并计算IC50;后用金正均Q值法评价用药效果.结果 miR-203转染至K562细胞,联合As2O3显著抑制K562细胞增殖,抑制效果较各单独使用组作用明显增强.As2O3浓度为0.05,0.1,0.2和0.4 μmol/L时的抑制率分别为24.0%±5.0%,33.1%±1.5%,39.4%±3.4%和47.1%±5.5%.micRNA-203浓度为5,10,20和40 μmol/L时的抑制率分别为27.0%±6.7%,38.8%±3.2%,44.6%±3.0%和59.6%±3.7%.不同浓度梯度的As2O3联合20 μmol/L的micRNA-203抑制率分别为46.9%±3.2%,48.9%±3.9%,50.2%±5.5%和56.1%±1.9%.结论 当一定浓度的miR-203与不同浓度梯度的As2O3联合之后,对K562细胞的增殖抑制表现为相加作用,提高了K562细胞对As2O3的敏感性,为白血病的治疗提供新的依据.
