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14-3-3η文献资料
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14-3-3η蛋白的生物信息学分析及原核表达
目的 分析巨噬细胞不同极化状态下14-3-3ηmRNA表达及其生物信息,并构建14-3-3η蛋白原核表达载体,为研究其在巨噬细胞活化中的作用提供实验基础.方法 提取C57BL/6小鼠骨髓原代巨噬细胞mRNA,反转录后用实时定量聚合酶链式反应(PCR)检测14-3-3ηmRNA水平的改变.运用ProtParam tool、SOPMA等在线软件对14-3-3η氨基酸序列进行分析.以小鼠巨噬细胞cDNA为模板,采用PCR的方法扩增14-3-3η基因,插入pGEX-4T-3载体中,双酶切和测序鉴定正确的重组质粒转化入大肠杆菌BL21菌株,用异丙基硫代半乳糖苷诱导其原核表达并纯化,SDS-PAGE法和Western blotting法对融合蛋白进行鉴定.采用Graphpad prism 5软件进行统计分析.样本比较均采用配对t检验.结果 M1型巨噬细胞14-3-3η表达降低,M2型趋势相反.生物信息学表明14-3-3η蛋白其二级结构中主要为α-螺旋(占62.60%)且疏水性较差(疏水系数为-0.607).酶切和测序结果提示重组质粒pGEX-4T-3-14-3-3η构建成功.SDS-PAGE和Western blotting结果表明融合蛋白谷胱甘肽-S-转移酶(GST)-14-3-3η成功表达和纯化.结论 本实验对14-3-3η进行了初步的生物信息学分析,成功表达并纯化融合蛋白GST-14-3-3η,为14-3-3η在巨噬细胞极化上的功能研究奠定了实验基础.
