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稳定沉默Beclin1基因的胰腺腺泡细胞株AR42J的建立
目的 采用RNA干扰技术沉默大鼠胰腺腺泡细胞AR42J的Beclin1基因表达,构建稳定的Beclin1基因沉默的AR42J细胞系.方法 设计并合成3种靶向大鼠Beclin1 mRNA的shRNA及阴性对照shRNA,分别插入质粒GV112,重组质粒分别命名为p-sh-Beclin1-1、p-sh-Beclin1-2、p-sh-Beclin1-3 及p-shRNA-NC.应用lipo3000将重组质粒瞬转入AR42J细胞,应用RT-PCR检测细胞Beclin1 mRNA表达,筛选出沉默效率高的质粒,在293T细胞内经慢病毒包装(LV-shBeclin1),感染AR42J细胞,应用嘌呤霉素筛选,采用RT-PCR及蛋白质印迹法分别检测病毒感染细胞Beclin1 mRNA和蛋白表达.结果 重组质粒经琼脂糖凝胶电泳分离及测序证实shRNA序列符合预期.p-sh-Beclin1-1、p-sh-Beclin1-2、p-sh-Beclin1-3及p-shRNA-NC转染后AR42J细胞Beclin1 mRNA表达抑制率分别为(17.8±4.0)％、(30.6±2.8)％、(45.8±7.7)％、(7.0±11.8)％.3个p-sh-Beclin1转染细胞的表达抑制率均较未转染细胞显著增加,差异有统计学意义(P值均＜0.05),而转染p-shRNA-NC细胞的表达抑制率与未转染细胞的差异无统计学意义.抑制率高的p-sh-Beclin1-3经慢病毒包装,感染AR42J细胞,感染细胞的BeclinmRNA表达抑制率为(86.1±1.2)％,蛋白表达抑制率为(87.9±2.8)％,与未感染细胞的差异均有统计学意义(P值均＜0.01).结论 成功建立Beclin1基因沉默的AR42J细胞株,为探讨Beclin1基因在急性胰腺炎发病机制中的作用提供新的细胞模型.
