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抑癌基因ppENK甲基化在胰腺癌发病机制中的作用
目的 检测胰腺组织ppENK基因甲基化状态,探讨ppENK基因甲基化在胰腺癌发生发展过程中的作用.方法 采用甲基化特异性PCR(MSP)法检测胰腺癌组织、胰腺癌细胞株、正常胰腺组织中ppENK基因甲基化状态,分析其与临床病理特征的关系.RT-PCR法检测组织及细胞ppENKmRNA表达.应用去甲基化药物5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-dC)处理胰腺癌细胞株(PANC1、AsPC1),采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞的增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期,蛋白质印迹法检测DNA甲基转移酶3a(DNMT3a)蛋白表达.结果 正常胰腺组织表达ppENK mRNA,基因非甲基化.胰腺癌组织ppENK基因甲基化率为90.3％ (28/31),ppENK基因甲基化与临床病理特征无相关性.SW1990、PANC1、PC3、AsPC1、PuPan-1胰腺癌细胞株均无ppENK mRNA表达,基因均表现为甲基化,ppENK mRNA表达与其甲基化呈负相关.5-Aza-dC处理后,PANC1、AsPC1细胞的ppENK基因被去甲基化,ppENK mRNA恢复表达；细胞的增殖呈浓度依赖性被抑制；细胞凋亡率增加[(31.57±6.76)％比(3.21±1.43)％,P=0.002,( 16.6±8.22)％比(3.82±1.71)％,P=0.058]；DNMT3a表达减少；PANC1的G1期细胞比例显著增加[(67.87±2.72)％比(54.57±7.18)％,P=0.040],S期细胞比例显著减少[(22.37±4.31)％比(33.73±4.63)％,P=0.036],AsPC1的G1期、S期细胞比例无明显变化(P =0.236、0.075).结论 ppENK基因甲基化是引起ppENK表达抑制的重要分子事件.ppENK基因去甲基化后可抑制胰腺癌细胞增殖,促进凋亡,细胞周期被阻滞在G1期,DNMT3a蛋白表达减少.
关键词： 胰腺肿瘤 前脑啡肽原基因 DNA甲基转移酶3a 甲基化 -
人前脑啡肽原基因在体细胞系细胞的表达
目的 检测人前脑啡肽原基因(hppe)鼠、犬、人体细胞系细胞的表达水平,评估转脑啡肽基因细胞系用于细胞镇痛的可行性.方法 采用磷酸钙共沉淀法或脂质体包裹法,将重组质粒pCMVhPPE(pE)单独或与pRSVneo(pN)共转染导入三种哺乳动物体细胞系细胞(NIH/3T3,MDCK,WISH)中.用G418培养液筛选阳性共转染细胞,扩增培养.以放射免疫法测定细胞培养上清液中脑啡肽(ENK)的含量.结果 双质粒共转染加G418筛选所获转化细胞的ENK分泌量10～20ng/105个细胞明显高于pE质粒单转染者的4～6ng/105个细胞(P＜0.01).两者的基因瞬时表达水平无显著性差异(P＞0.05).双质粒共转染时,脂质体包裹法和磷酸钙共沉淀法的基因转染率相仿,前者的转染率和表达水平为0.1%和13～20ng/105个细胞,后者为0.08%和6～10ng/105个细胞,两者无显著性差异(P＞0.05).结论 hppe基因能在体细胞系细胞中良好表达,转化细胞的ENK分泌量(107～109个细胞)可以满足大鼠脊髓镇痛的需要.
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胰腺占位性病灶细针穿刺活检标本中ppENK和TFPI-2基因甲基化检测的可行性及其应用
目的 检测胰腺组织ppENK和TFPI-2基因甲基化状态,探讨胰腺占位性病灶细针穿刺活检标本中ppENK和TF-PI-2基因甲基化检测的可行性及其应用.方法 采用重亚硫酸盐测序PCR(BSP)法检测86例胰腺占位性病变组织中 ppENK和TFPI-2基因启动子区CPG岛的甲基化状态,采用单因素及多因素回归Logistic回归分析ppENK基因和TFPI基因甲基化检测的诊断价值,以及EUS-FNA联合基因甲基化检测在胰腺占位性病变中的诊断意义.结果 本研究86例病例中,甲基化成功率为91. 9％(79/86),TFPI-2和 ppENK基因的甲基化检测率分别为95.9％(75/79)和 91. 1％(72/79).肿瘤组与炎症组以及肿瘤组和对照组的甲基化率差异均有统计学意义(P＜0. 05),而炎症组与对照组甲基化率差异无统计学意义.受试者工作特征曲线结果显示:TFPI-2基因、ppENK基因甲基化水平诊断胰腺癌的敏感度分别为83. 6％、74. 6％,特异度分别为81. 8％ 、86.4％,诊断率分别为89. 7％ 、81. 2％,以TFPI-2基因或ppENK基因甲基化水平诊断胰腺癌的敏感度为92.5％,特异度为 79. 8％,而以基因TFPI-2和ppENK甲基化水平进行诊断,其敏感度为74. 6％,特异度为91. 7％.结论 TFPI-2和 ppENK基因在胰腺肿瘤组织中具有高甲基化水平,且具有良好的敏感性和特异性,是胰腺癌的有利诊断指标,结合 EUS-FNA,能够有效提高胰腺占位性病变的术前诊断.
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NIH3T3细胞中前脑啡肽原基因的稳定表达
目的:利用重组逆转录病毒载体pLNCX2-pENK,研究pENK基因在NIH3T3细胞中是否能够稳定表达.方法:用pLNCX2-pENK转染病毒包装细胞PT67,其病毒上清液感染NIH3T3细胞,检测pENK基因是否整合人NIH3T3细胞基因组中并通过RT-PCR及放射免疫法检测基因表达情况.结果:病毒基因组整合到NIH3T3细胞基因组中,并检测到目的基因转录及蛋白表达.结论:用逆转录病毒载体能将pENK基因整合到靶细胞NIH3T3基因组中,且该基因能长期稳定表达,为慢性疼痛的进一步治疗奠定了基础.
