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肺炎链球菌自溶素蛋白LytA对社区获得性肺炎的血清学诊断意义
目的 通过原核表达技术获取肺炎链球菌(ATCC49619)自溶素LytA重组蛋白(rLytA),以此为抗原检测其抗体在健康人及社区获得性肺炎(CAP)患者外周血中的水平,为CAP的血清学诊断奠定基础.方法 根据Genbank中公布的肺炎链球菌M66菌株LytA基因序列设计合成特异性引物.以ATCC49619株基因组DNA为模板,采用原核表达技术获取相对分子质量为56 000的重组蛋白rLytA.以rLytA为抗原,建立ELISA反应模式,测定健康人及CAP患者相应IgM抗体,并与痰培养结果比较.应用χ2检验评价结果差异.结果 通过原核表达技术成功获得肺炎链球菌重组蛋白rLytA.以此为抗原,测得CAP患者血清中IgM类抗LytA的抗体滴度高于健康对照组,差异有统计学意义(P=0.000),诊断的敏感度、特异度分别为27.8%和100.0%,痰培养的敏感度和特异度分别为19.4%和72.2%.血清学诊断的敏感度与痰培养相比差异无统计学意义(χ2=0.693,P=0.405),但特异度显著高于常规痰培养结果(χ2=14.316,P=0.000).阳性预测值为100%,IgM类抗LytA抗体的阳性结果对肺炎链球菌的感染具有确诊价值.结论 以重组蛋白LytA为抗原建立ELISA反应模式,检测IgM类LytA抗体,可能为链球菌感染性肺炎提供一条早期快速、客观诊断的途径.
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肺炎链球菌不同菌株自溶酶基因的克隆、序列分析及重组表达
目的克隆肺炎链球菌自溶酶(LytA)的基因序列,并进行重组表达.方法分别提取不同临床分离株的基因组DNA,根据已知肺炎链球菌野生R6株LytA基因序列设计引物,进行PCR扩增,将获得的目的基因片段克隆入原核表达质粒,然后测序;利用生物信息学方法,对不同临床分离株LytA基因序列进行比较分析,同时进行LytA基因的重组表达.结果从不同临床分离株的基因组中均扩增出完整的LytA基因片段,成功构建了重组质粒pGEX-4T-1-LytA.比较不同临床分离株LytA基因的DNA序列及推测的氨基酸序列,发现各株LytA基因序列及氨基酸序列间存在差异.通过异丙基巯基半乳糖(IPTG)诱导,LytA基因在大肠埃希菌JM109中得到高效表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果显示pGEX-4T-1-LytA融合蛋白相对分子质量约62 000,与理论预测一致.结论序列分析发现各分离株的LytA基因序列及氨基酸序列间存在差异,但同源性极高,推测LytA基因序列保守,可用于疫苗研发.
