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大容量噬菌体抗体库的构建及鉴定
目的构建大容量噬菌体单链抗体库,从中筛选人源单链抗体(ScFv). 方法从正常成人外周血和新生儿脐血分离淋巴细胞,用RT-PCR扩增轻链可变区基因(VL)和重链可变区基因(VH),通过重叠PCR法将VH和VL拼接形成ScFv基因,并克隆入噬菌体表达载体PDF,得到ScFv初级噬菌体抗体库.以高MOI超感染cre+菌株BS1365,通过loxp-cre定位重组系统,介导轻重链的组合配对,得到大容量抗体库,用多种抗原对抗体库进行生物淘筛,鉴定抗体库的性能. 结果获得了6×1010的大容量单链噬菌体抗体库.分别用卵清蛋白、胃蛋白酶、铁蛋白、人角蛋白、人TNF-α、地高辛等6种抗原进行筛选,均得到多样性的特异性噬菌体抗体. 结论经loxp-cre定位重组系统在单细胞内重组成功地构建了大容量单链噬菌体抗体库,初步尝试对6种抗原进行筛选均获成功,提示该抗体库可用于制备具有应用前景的人源抗体.
关键词： 噬菌体抗体库 Loxp-cre重组系统 单链抗体 -
用CDR3导向抗体库法对鼠抗人膀胱癌单抗进行人源化
目的构建含鼠单抗CDR3的人源噬菌体抗体库,对膀胱癌鼠单抗进行人源化. 方法通过重叠PCR及DNA重组技术,将抗膀胱癌鼠单抗BDI的CDR3区与人淋巴细胞来源的多样化的VH和Vκ组合,构建含BDI CDR3的人源噬菌体抗体库;利用loxp-cre定位重组系统,增加轻、重链的组合配对,获大容量抗体库;用膀胱癌细胞(EJ)从中筛选人源化抗膀胱癌单抗Fab段,ELISA方法对所筛克隆进行特异性鉴定,同时运用竞争抑制实验对所筛特异性克隆进行抗原表位的核实. 结果首先构建了库容为2×107的含鼠CDR3区的人源噬菌体抗体库;经过在cre+细菌胞内的定位重组后,获得库容为1010的大容量噬菌体抗体库;用EJ细胞筛选到可与其特异结合的人源性Fab段;竞争抑制实验表明所获人源抗体片段与亲本鼠源单抗结合同一抗原表位. 结论在没有亲本鼠单抗基因,仅了解其CDR3序列的条件下,可通过CDR3导向,构建大容量抗体库,筛选到相应的人源化抗体基因.
关键词： 噬菌体抗体库 鼠单抗人源化 Loxp-cre重组系统 膀胱癌 -
用于大容量噬菌体抗体库的表达载体的构建及鉴定
目的:构建一个适用于大容量抗体库的噬菌体抗体表达载体.方法:通过插入人工合成寡核苷酸、PCR介导的定位突变等技术,将载体p3MH进行改造,使之更适于构建大容量抗体库.通过噬菌体抗体的表达、ELISA及细胞内重组试验鉴定所获得的表达载体.结果:通过插入loxp511和loxp序列,将Lac启动子更换为阿拉伯糖启动子、改造抗体基因克隆位点等,将p3MH改造成pAL.经检测pAL可以表达具有功能的Fab噬菌体抗体,其表达调控更为严密,可以在cre+细菌胞内发生预期的loxp-cre介导的定位重组.结论:所获得的表达载体pAL适用于构建大容量Fab噬菌体抗体库.
关键词： 噬菌体 抗体库 Loxp-cre重组系统 体内重组
