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Gluc-GFP文献资料
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Gluc-GFP 双标记系统的构建及验证
目的：构建含Gluc-GFP的双标记系统，为研究病毒的体外标记和活体成像提供技术手段。方法根据文献报道合成split-GFP基因，将GFP拆分为G1-10与G11两部分，分别构建含G1-10与G11的pcDNA3．1表达质粒并通过荧光观察验证其相互作用。然后通过融合PCR技术将Gluc基因与G11基因通过Linker连接并插入到pcDNA3．1上，与G1-10表达质粒共转染293T细胞，测定细胞上清中Gluc荧光素酶的活性，并进行GFP荧光观察。为了更方便对病毒进行细胞水平的观测和筛选，利用慢病毒表达系统构建能稳定表达G1-10的MDCK细胞系，再向细胞系中转染G11质粒，通过红色荧光蛋白（ RFP）标记和嘌呤霉素的抗性对细胞系以及GFP活性进行筛选与验证。结果split-GFP基因共转染细胞后的荧光观察结果证实了split-GFP拆分策略的可行性。 Gluc-G11与G1-10质粒共转染后，细胞能够发出明亮的绿色荧光，上清中荧光素的活性也较高。在此基础上，建立的G1-10 MDCK细胞系能够稳定表达出G1-10，用G11质粒转染该细胞系后，可检测到GFP荧光。结论成功构建了含Gluc-GFP的双标记系统，split-GFP拆分策略可行，Gluc-G11不会影响荧光素酶Gluc的生理活性；G1-10细胞系的稳定表达可简化双标记系统的制备，为在细胞和活体水平研究病毒致病机制提供技术手段。
