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金黄色葡萄球菌调节基因mgrA高表达对苯唑西林耐药性的影响
目的观察金黄色葡萄球菌调节基因mgr高表达对苯唑西林耐药性的影响.方法用PCR方法从金黄色葡萄球菌N315的染色体中扩增包括mgrA基因的片段(717bp),克隆到温敏穿梭载体pYT3的BamHⅠ位点,将所构建的载体pYT641电转化导入受体,同时利用同源重组技术敲除mgrA基因,观察高表达株N315(pYT641)和基因敲除株N315△641对苯唑西林耐药性的变化程度;利用高压液相技术分析mgrA基因高表达和基因敲除对细菌细胞壁交联度的影响,RNA印迹杂交进一步分析mgrA基因对细菌耐药相关基因和细菌毒力调节基因、细菌毒力基因的影响.结果高表达株N315(pYT641)mgrA的表达量明显增加,低抑菌浓度(MIC)测定表明高表达株N315(pYT641)对苯唑西林的敏感性比受体菌N315降低了16倍,MIC从8 mg/L增加到128 mg/L,而基因敲除株N315△641的敏感性比受体菌N315增加了2倍;细菌细胞壁成分分析表明基因敲除株的细菌细胞壁交联度明显降低,提示mgrA基因可能影响细菌细胞壁的合成;RNA印迹分析表明mgrA基因不仅可使sigB和agrA基因高表达,而且影响细菌毒力基因spa和细胞壁合成相关基因pbp4、fmtB的表达.结论mgrA可能是除agrA、sarA、sigB外一个新的影响细菌耐药水平的调节基因.
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金黄色葡萄球菌多药耐药调节基因MgrA蛋白的纯化
目的:获得大量重组MgrA蛋白,为深入研究其功能提供必要的材料.方法:用构建好的含有目的基因mgrA的His融合表达载体,转化大肠杆菌感受态细胞,在IPTG诱导下进行高密度发酵,对所得蛋白进行纯化、复性,以SDS-PAGE凝胶电泳检测鉴定其特性.结果:①表达诱导菌体的裂解上清经金属螫合亲和层析,聚丙烯酰胺凝胶电泳证实获得初步纯化的蛋白中仍含一些杂蛋白.②重组获得多个蛋白洗脱峰,再经聚丙烯酰胺凝胶电泳法证实获得纯度较高的目的蛋白.结论:获得了纯化的MgrA蛋白重组蛋白.
