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肠道病毒5'-非翻译区测序分型的应用评估
目的 评估5’-非翻译区(5’-untranslated region,5’-UTR)扩增测序法对临床标本直接进行肠道病毒(enterovirus,EV)血清型分型的价值.方法 收集实时荧光聚合酶链反应(real-time PCR)检测EV通用型核酸为阳性的肛拭518份、鼻拭148份,采用5’-UTR区逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)对标本中的EV进行扩增、测序、比对及血清型分型,与VP1(viral protein 1)区简并引物巢式PCR测序分型方法比较,两者不一致的标本经EV血清型特异性RT-PCR验证.结果 666份EV通用型核酸为阳性的标本,5’-UTR和VP1区各分型成功553例(83.0％)和318例(47.7％),P＜0.001;以VP1法为参考,对肛拭中主要检出的血清型CoxA6(217例)、CoxA 16(88例)、EVA71(40例)、CoxA10(28例)和CoxA4(27例),5’-UTR法敏感度(57.1％～100％)、特异度(67.4％～98.1％)以及方法一致性(kappa值0.188 ～0.847),均因血清型而异;对鼻拭中主要检出的血清型EVD68(15例),5’-UTR法敏感度100％,特异度91.1％,一致性差(kappa值0.217).分型不一致标本,经CoxA6、CoxA 16、EVA71、CoxA10和EVD68型特异性RT-PCR验证,大部分得以确认.以VP1法联合型特异性RT-PCR法为参考,5’-UTR法的敏感度和特异性以及与参考方法的一致性均提高.结论 5’-UTR对肠道病毒的分型的敏感度和特异度因血清型而异,应用时应根据研究目的综合考虑.
关键词： 肠道病毒 5'-非翻译区 逆转录·聚合酶链式反应 测序 分型 -
脱氧核酶在转基因肝癌细胞中对HCV 5'-非编码区的抑制活性
目的观察特异性脱氧核酶(DRz)在丙型肝炎病毒(HCV)5'-非编码区(5'-NCR)转基因肝癌细胞株中对靶RNA的抑制活性.方法采用5'-GGCTAGCTACAACGA-3'基序为活性中心,分析HCV 5'-NCR中符合5'…R↓Y…3'(R=A/G,Y=U/C)特征的位点及5'-NCR的二级结构以确定靶位,设计并合成HCV靶向性脱氧核酶DRz-232、DRz-127、DRz-84、DRz1以及对应的两端被硫代修饰的DRz(TDRz)和活性中心区人工突变的硫代DRz(MDRz).用脂质体转染法将导入HCV 5'-NCR及部分C区(5'-NCR-C)的转基因肝癌细胞株HepG2.9706中,作用一定时间后,用化学发光法检测荧光素酶活性的变化,计算抑制率.选择抑制率较高者进行时效关系的观察和不同浓度抑制效果的比较.结果各DRz和对应TDRz的活性无明显差别.DRz-127/TDRz-127和DRz1/TDRz1的抑制活性相对较高,终浓度为0.5μmol/L作用24 h抑制率分别达53.2%/50.6%和44.7%/43.3%.各DRz/TDRz的抑制率均高于对应的MDRz,其中DRz-127/TDRz-127与MDRz-127(41.2%)相比抑制率有显著性差异,P＜0.05.在0.25～0.75 μmol/L范围,抑制率随药物浓度的升高而增高.在所观察的时间点中,加药后24 h抑制率高,3 d后抑制率显著下降;DRz抑制率的下降快于TDRz.结论靶位合适的HCV特异性脱氧核酶在转基因肝癌细胞中对靶RNA可能既存在反义抑制作用,又存在剪切活性,可能是一种有希望的抗病毒基因治疗手段.经适当硫代修饰的TDRz在细胞内可能更稳定.
