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布氏菌疫苗效力评价小鼠模型的建立
目的 建立布氏菌疫苗效力评价小鼠模型,为布氏菌疫苗有效性评价奠定基础.方法 测定感染布氏菌株动物的脾脏细菌数,比较菌株毒力,筛选出布氏菌疫苗效力评价用布氏菌株.通过小感染剂量的测定为效力评价的感染剂量提供基础数据.检测动物体内布氏菌增殖情况,确定动物解剖时间.将不同剂量的布氏菌活疫苗免疫小鼠,4周后用布氏菌强毒菌株皮下感染,感染4周后将动物解剖测定脾脏细菌数,分析疫苗保护效果.结果 筛选出布氏菌疫苗效力评价感染用布氏菌株,该菌株的皮下小感染剂量为300 CFU,感染后4周动物脾脏细菌数达到较高且稳定水平.布氏菌活疫苗免疫小鼠后能产生较好的保护效果,免疫剂量与保护力水平之间有较好的量效关系.结论 建立了布氏菌疫苗效力评价小鼠模型,为新型布氏菌疫苗的研制奠定了基础.
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布氏菌活疫苗滴鼻与皮下接种的免疫效果的比较
目的：将布氏减毒活疫苗通过滴鼻和皮下注射两种方式免疫小鼠，比较两种方式的免疫效果。方法采用两种方法免疫动物，免疫4周后分离血清、脾脏淋巴细胞及制备肺泡灌洗液。ELISA 法检测免疫动物血清中总 IgG抗体；ELISA法检测免疫动物肺泡灌洗液中总 IgG、IgA抗体；ELISPOT法检测分泌 IFN-γ、IL-4的脾脏淋巴细胞数目，以及用 ELISA方法检测体外再刺激后小鼠脾细胞分泌细胞因子水平；流式细胞术对 T细胞亚群进行分类；用羊布氏菌弱毒株 M5通过滴鼻和皮下注射两种方式攻击免疫动物，通过脾脏布氏菌计数评价并比较两种免疫方法的保护效果。结果 ELISA、ELISPOT和 T淋巴细胞亚群分类结果显示，两种免疫途径均能诱导体液免疫、细胞免疫应答，两者间无显著差异。BALB/c 小鼠滴鼻攻击试验结果显示滴鼻免疫组和皮下免疫组脾脏中布氏菌数量的对数值均为0，阴性组脾脏中布氏菌数量的对数值为6.24±0.07；皮下攻击试验显示滴鼻免疫组脾脏中布氏菌数量的对数值为1.69±0.07，皮下免疫组为3.03±0.03，阴性组为5.29±0.06。结论两种免疫途径均能诱导体液免疫、细胞免疫应答，滴鼻免疫组的免疫保护作用显著优于皮下注射组，提示滴鼻免疫是一种高效的免疫途径。
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布鲁杆菌M16株pgm基因突变活菌苗株的构建和鉴定
目的 构建自杀性质粒载体,对布鲁杆菌M16株pgm基因进行精确突变,并对得到的pgm基因突变活菌苗株进行鉴定.方法 在puc19质粒载体上构建正向筛选标记--蔗糖敏感基因和反向筛选标记--卡那霉素抗性基因融合序列;用卡那霉素抗性基因融合序列对布鲁杆菌pgm基因进行修饰(插入突变),完成pucS1.6K自杀性质粒载体的构建;通过电转化获得布鲁杆菌M16株pgm基因突变菌株;应用PCR方法对pgm基因突变菌株进行鉴定.结果 鉴定结果显示,布鲁杆菌M16株pgm基因在卡那霉素抗性基因插入后失活,突变后的布鲁杆菌M16株pgm基因DNA片段长度约为3525 bp,与预期的相符,布鲁杆菌M16株pgm基因突变菌株构建成功.结论 构建的自杀性质粒载体能成功对布鲁杆菌进行精确毒力基因突变,为获得布鲁杆菌突变株提供了一个有效的技术平台,也为新型减毒活疫苗的研制奠定了基础.
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布鲁杆菌基因工程疫苗免疫保护效率的初步观察
目的比较布鲁杆菌6种抗原表位所获得的基因工程疫苗的免疫保护效率.方法布鲁杆菌核糖体蛋白L7/L12、胞质蛋白P39、细胞表面蛋白BCSP31、二氧四氢喋啶合成酶BLS、16.5×103的外膜蛋白PAL和翻译起始因子IF3的基因片段与真核表达载体pcDNA3.1(+)构建的核酸疫苗及上述6条片段转入pET32a(+)后诱导表达的的重组蛋白免疫小鼠,3次免疫后进行攻毒实验,对其免疫保护效率进行初步观察.结果L7/L12和BLS的重组蛋白疫苗和核酸疫苗都产生了非常显著的保护作用,P39的核酸疫苗、IF3和BCSP31的重组蛋白疫苗也产生了非常显著的保护作用,其中L7/L12核酸疫苗的保护效率高.结论初步认为布鲁杆菌的优势抗原表位所获得的基因工程疫苗可产生一定的抗布鲁杆菌作用,可作为未来布鲁杆菌新型疫苗的候选者,有进一步研究的价值.
