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Wnt3a基因修饰减轻阿糖胞苷诱导的小鼠骨髓间充质干细胞损伤的体外研究
本研究探讨Wnt3a基因修饰对小鼠骨髓间充质干细胞(MSC)抗阿糖胞苷损伤的作用.通过重组腺病毒系统感染小鼠MSC,建立能够稳定高效表达Wnt3a基因的基因修饰MSC;在体外培养体系中加入不同浓度的阿糖胞分别诱导对基因修饰MSC与未经基因修饰MSC的损伤,设置对应的对照,通过CCK-8法、流式细胞术检测MSC的生长增殖以及凋亡情况;用Western blot测定MSC中与细胞凋亡有关的BCL-2蛋白的表达水平.结果表明,阿糖胞苷对基因修饰MSC的增殖抑制程度较未经基因修饰MSC明显减低,差异有统计学意义(p<0.05);去除阿糖胞苷后,基因修饰MSC的增殖生长能力在72小时后就开始恢复,而未经基因修饰MSC的增殖生长能力在72小时后仍然被抑制.在凋亡方面,阿糖胞苷诱导的基因修饰MSC的凋亡率明显降低(p<0.05),与未经基因修饰MSC相比,基因修饰MSC中BCL-2蛋白的表达上调(p<0.05).结论:Wnt3a基因修饰能明显减轻阿糖胞苷对小鼠骨髓MSC的损伤作用.
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火针对脊髓损伤大鼠神经干细胞Wnt/β-catenin通路基因表达的离体研究
目的 观察火针对脊髓损伤Wnt/β-catenin通路上神经干细胞Wnt、β-catenin基因的调控作用.方法 将60只SD雌性大鼠随机分为空白组5只、假手术组5只、模型组25只、火针组25只,模型组和火针组大鼠又分为1 d组、3 d组、7 d组、10 d组和14 d组;采用改良的Allen's法对模型组和火针组造模,观察各组BBB评分,Wnt3a和β-catenin基因表达变化.结果 在7 d、10 d时模型组和火针组BBB评分明显高于同组前一时相,差异具有统计学意义(P<0.05);火针组大鼠在治疗后各时间点BBB评分明显高于模型组,差异具有统计学意义(P<0.05).在7 d、10 d时模型组和火针组Wnt3a基因表达量较同组前一时相均增加(P<0.05);在7 d、10 d时火针组Wnt3a基因表达量高于模型组,差异具有统计学意义(P<0.05);β-catenin基因表达水平变化趋势与Wnt3a基本一致.结论 火针可调控脊髓损伤神经干细胞Wnt3a、β-catenin基因表达.
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重组质粒pEGFP-N2-Wnt3a的构建和鉴定
目的 构建大鼠Wnt3a真核表达重组质粒.方法 从大鼠脊髓中提取总RNA,利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法扩增编码大鼠Wnt3a的基因片段,应用基因重组技术将大鼠Wnt3a基因片段克隆到真核表达载体pEGFP-N2中,经XhoI及EcoR I双酶切和单酶切证实所构建的载体.结果 RT-PCR方法获得大鼠Wnt3a的基因片段,限制性内切酶酶切分析和PCR法鉴定表明为正确重组质粒.结论 构建的真核表达重组质粒pEGFP-N2-Wnt3a经过鉴定,结构正确,为进一步转染骨髓基质干细胞(BMSCs)和脊髓损伤(SCI)治疗提供研究基础.
关键词： Wnt3a基因 pEGFP-N2真核表达载体 脊髓损伤
