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原核基因工程制备新型重组α-半乳糖苷酶应用于人B→O血型改造的研究
本研究利用基因工程方法制备脆弱类杆菌来源的新型α-半乳糖苷酶并将其应用于人B→O血型改造.在获得了能够表达细菌α-半乳糖苷酶工程菌株的基础上,从诱导时间、诱导剂浓度两个方面对工程菌株的诱导条件进行优化,获得细菌α-半乳糖苷酶的佳可溶性表达条件;超声上清经过阳离子交换层析和阴离子交换层析等方法进行纯化.利用纯化后的α-半乳糖苷酶在磷酸盐缓冲液(pH 6.8)中处理B型红细胞2小时,制备O型红细胞.结果表明细菌α-半乳糖苷酶佳诱导表达条件为:37℃、起始D(600)为0.8,IPTG浓度为0.1 mmol/L,诱导时间为2小时.纯化后α-丰乳糖苷酶的纯度为电泳纯,比活由纯化前的0.42 U/mg提高到了2.1 U/mg.该酶在26℃、接近中性的pH条件(6.8)下经2小时可将B型红细胞改造成O型红细胞,需要的酶量为225μg/ml红细胞.结论:建立了重组细菌α-半乳糖苷酶的表达纯化工艺,制备的重组α-半乳糖苷酶可有效地将B型红细胞改造成O型红细胞,为B→O血型改造提供了更有效的工具酶.
关键词： 基因重组α-半乳糖苷酶 血型改造 B→O血型改造 -
用α-半乳糖苷酶制备可供输注的人通用型O型红细胞
研究的目的是将人群中28%的B型血改造成通用O型血,提高O型血的储存和使用比例,以缓解战争、恐怖袭击、突发事件等紧急状态下对O型血的大量需求.用α-1.3半乳糖苷酶作为B→O血型改造的工具酶,摸索改造一个使用单位B型血红细胞(100ml)的佳条件.结果实现了在密闭、无菌条件下使用50 U/ml工具酶,pH5.6,26℃2小时,进行B→O的血型改造.结论:改造后的通用型O型血红细胞符合生物制品检定规程的要求,并可在4℃存放21天.
关键词： 输血 O型红细胞 α-1.3半乳糖苷酶 血型改造 B→O血型改造 -
甲氧基聚乙二醇修饰改造RhD(+)血型的初步研究
Rh血型与ABO血型一样是重要的血型系统,Rh血型不符会引起严重的输血反应及新生儿溶血病.中国人群中RhD阴性血型的比例仅为0.2%-0.5%,将RhD阳性红细胞改造成RhD阴性红细胞在临床输血中有重要的意义.本研究用4种不同端基的甲氧基聚乙二醇(mPEG),修饰A型、B型、AB型和O型的RhD(+)红细胞,比较4种mPEG衍生物对RhD抗原的修饰效果.同时观察mPEG修饰对红细胞形态、结构和功能的影响.结果表明,mPEG-BTC(苯并三唑端基PEG)较其他3种PEG的修饰效果好,在1mmol/L时可以有效地遮蔽红细胞表面RhD抗原,而对红细胞形态、渗透脆性、自身溶血、乙酰胆碱酯酶、胆固醇、ATP、2,3-DPG含量以及变形性无影响.结论:初步实现了将RhD(+)红细胞修饰改造成RhD(-)红细胞的目的.
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全自动快速密闭洗涤法在红细胞血型改造中的应用
目的 探讨用全自动密闭洗涤系统对血型改造的红细胞(改型红细胞)进行洗涤,以延长改型红细胞的保存期并提高其制品质量的可行性.方法 用美国血液技术公司生产的Haemonetics全自动血细胞洗涤系统洗涤改型红细胞,考察洗涤后和保存不同时间细胞膜的结构和功能.检测项目包括溶血指标、K+、Na+、乙酰胆碱酯酶、胆固醇、ATP、红细胞的回收率和细菌培养等.结果 与常规洗涤法相比,全自动密闭洗涤法在红细胞的回收率、细菌培养结果和红细胞的长期保存指标上有明显的优势(P＜0.05).结论 全自动快速密闭洗涤法用于改型红细胞洗涤比常规洗涤法更安全、快速、有效,并可延长改型后的红细胞保存期.
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利用新型α-半乳糖苷酶进行B→O血型改造
目的 利用原核生物来源的a-半乳糖苷酶进行B→0血型改造研究.方法 应用PCR的方法从脆弱类杆菌(Bacteriodes fragilis)中克隆了新型a-半乳糖苷酶基因,构建原核生物表达载体,转化大肠杆菌BL21(DF3),IPTG诱导a-半乳糖苷酶的胞内可溶性表达,应用重组酶的上清液进行B型红细胞(RBC)初步酶解试验.结果 重组酶分子量约为64.6kD,超声破碎的菌液上清中的酶活力约为2U/ml.在26℃及pH 6.8的等渗柠檬酸-磷酸氮二钠缓冲体系中,2h内完全酶解200μlB型RBC需要30μl的上清液,酶解后的B型RBC与抗-B和抗-A单克隆抗体不凝集,流式细胞术检测结果显示酶解后B型RBC的血型抗原呈现0型特征.结论 重组的α-半乳糖普酶可以有效的将B型RBC转变为0型RBC.
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ABO血型改造制备通用型红细胞
血型改造的理论基础、研究意义及国外研究进展ABO血型系统是临床输血重要的血型系统,在所有的输血死亡事故中,每年因ABO血型不相合而导致的输血死亡事故居首位,约为69.7%[1].
关键词： 血型改造 通用型红细胞 α-半乳糖苷酶 α-N-乙酰半乳糖胺酶 -
重组血型改造工具酶稳定性的研究
目的 研究血型改造工具酶,重组咖啡豆α-半乳糖苷酶在不同保存条件下的稳定性.方法 以酶解B型红细胞的活性和纯度作为主要检测指标,考察重组α-半乳糖苷酶的热稳定性.重组α-半乳糖苷酶在70℃条件下保存1d,37℃保存60 d,室温、4、-20、-70℃分别保存6个月,定期取样观察样品的外观,检测样品的pH值、纯度、酶活性,并进行无菌试验;为确保临床使用中的安全性和有效性,我们对4℃保存的样品进行了长达3年的观察.结果 重组α-半乳糖苷酶在70℃保存1 d后失活,37℃保存2个月后活性降低了11.5%,室温保存6个月后活性降低了19%,-70℃保存6个月后活性降低了13%,4℃、-20℃保存的样品6个月内各项指标均正常,均未见蛋白明显降解,蛋白活性保持稳定.4℃保存3年的样品酶活性保持稳定,可按原剂量在26℃,2 h内成功地将B型红细胞改造成O型红细胞.结论 重组α-半乳糖苷酶对热不稳定,应保存4℃或-20℃,在此条件下,有效期至少2年,能满足常规临床要求.
