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人白介素-2基因在原代培养骨骼肌细胞中的表达研究
目的对以人白介素-2在原代培养骨骼肌细胞中的表达作为肿瘤基因治疗模式进行新的探索; 方法将人白介素-2 cDNA片段与CMV启动子及RSV启动子重组,通过Lipofectin介导将得到真核表达载体pCMV-IL2和pRSV-IL2转入原代培养的骨骼肌细胞,并用免疫组织化学方法观察白介素-2的表达; 结果 pCMV-IL2和pRSV-IL2经酶切鉴定正确,免疫组织化学观察到约有10%左右细胞表达了白介素-2cDNA; 结论不同启动子表达情况并无差别,质粒DNA为今后肿瘤基因治疗提供了新的途径.
关键词： 人白介素-2 骨骼肌细胞 脂质体介导的基因转移 -
人白介素-2/人血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的表达
目的:构建编码人白介素-2/人血清白蛋白的重组表达质粒pPIH,在毕赤酵母(Pichia pastria)中进行表达,获得具有白介素-2(IL-2)活性的融合蛋白.方法:通过逆转录方法从人外周血单核细胞得到人IL-2的cDNA,再通过重叠PCR方法,将编码人IL-2的cDNA和编码人白蛋白的cDNA拼接起来,克隆至T载体获得含有融合基因IH的质粒pMD19/IH.用Eco RI和NotI 双酶切pMD19/IH和pPIC9K两种质粒,通过琼脂糖凝胶电泳分离,试剂盒纯化,将IH片段和pPIC9K连接获得表达型pPIH的重组质粒,利用电转化方法转化毕赤酵母KM71获得重组表达质粒pPIH;CTLL-2/MTT法测定融合蛋白中人IL-2活性.结果:成功构建了人白介素-2/人血清白蛋白的重组表达质粒pPIH,融合蛋白得到了较理想的表达;重组菌经甲醇诱导表达后含有融合蛋白IL-2-HSA发酵上清液表现100 U/mL的生物学活性.结论:成功获得具有人IL-2生物活性的重组人白介素-2/血清白蛋白融合蛋白,该研究结果未见文献报道.
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hIL-2与ZsGreen双基因共表达腺相关病毒的包装及鉴定
[目的]包装并鉴定带有人白介素2（hIL-2）及ZsGreen的双基因共表达的重组5型腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus 5, rAAV5），为今后利用5型重组腺相关病毒载体进行胰腺癌基因治疗提供研究基础。[方法]以5型腺相关病毒包装系统（helper-free system）为模版，PCR法扩增pLVX-IRES-ZsGreen和PES-IL-2模板上的IRES-ZsGreen和IL-2基因，利用酶切位点插入重组腺相关病毒骨架质粒，获得重组质粒pAAV-hIL-2-IRES-ZsGreen。经三质粒共转染AAV293细胞包装重组腺相关病毒rAAV5-hIL-2-IRES-ZsGreen。荧光显微镜下检测病毒包装效率，超速离心纯化、浓缩重组病毒，qPCR测定病毒的滴度。重组病毒转导细胞经荧光显微镜检测、外源基因经PCR检测证实病毒包装结果。[结果]5型重组腺相关病毒骨架质粒pAAV-IL-2-IRES-ZsGreen经双酶切和测序鉴定，确定其序列正确。荧光显微镜下观察三质粒共转染AAV293细胞72h后，病毒包装效率达90%以上。5型重组病毒感染HEK 293细胞48h有荧光出现，重组病毒基因组成功扩增出外源基因IL-2，证明有感染力的重组病毒包装成功。[结论]成功包装带有hIL-2及ZsGreen标记的双基因共表达重组腺相关病毒，滴度达到2.62×1012。
