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5-氮杂-2'-脱氧胞苷对HepG2细胞RUNX3基因表达及细胞增殖的影响
目的 探讨人肝癌细胞系HepG2经5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-2'deoxycytidine,5-Aza-CdR)处理后诱导高甲基化失活的RUNX3基因重新表达的可能性及对细胞生长的影响,寻找抗癌治疗的新靶点. 方法 RT-PCR检测抑癌基因RUNX3 mRNA的表达;MTT、集落形成实验观察细胞的生长活性;流式细胞术和透射电镜分析细胞周期及细胞凋亡的变化. 结果 肝癌细胞经不同浓度之5-Aza-CdR处理后,原无RUNX3 mRNA表达的细胞均检出基因重新表达,细胞生长速度出现不同程度减慢及细胞克隆形成率显著降低(P＜0.01).用药后肝癌细胞发生明显的S期阻滞,电镜显示肝癌细胞形态学改变. 结论 去甲基化制剂5-Aza-CdR能有效地激活肝癌细胞系HepG2因高甲基化所致RUNX3基因沉默的再转录,诱导该基因的表达,从而抑制肿瘤细胞生长.
关键词： 人肝癌细胞系HepG2 RUNX3基因 去甲基化制剂 -
MCFP慢病毒干涉载体及HepG2稳定细胞系的构建
目的:研究线粒体转运蛋白质超家族新成员SLC25A40(MCFP)RNA干扰(RNAi)慢病毒表达载体对人肝癌细胞系HepG2细胞中MCFP基因的沉默效果.方法:通过RNAi序列设计软件进行MCFP干涉片段设计,筛选出MCFP基因的RNAi有效靶序列,进一步合成靶序列的Oligo DNA,构建pSiCoR-MCFP慢病毒载体并包装产生慢病毒干涉毒液.运用病毒感染HepG2细胞获得稳定干涉MCFP的细胞株,利用PCR和Western blot方法检测稳定细胞株中MCFP的干涉效果.结果:成功构建具有MCFP干涉效果的慢病毒干涉载体并获得了稳定干涉MCFP及对照的HepG2细胞株.收集慢病毒上清,流式测定干涉病毒滴度为1.45×10m Pfu/L,对照病毒滴度为1.78×1010 pfu/L.PCR和Western blot实验均证实干涉MCFP后,HepG2细胞株中MCFP蛋白表达水平明显降低(P＜0.001).结论:成功构建具有MCFP干涉效果的慢病毒干涉载体及稳定干涉MCFP的HepG2细胞株.
关键词： 慢病毒 线粒体转运蛋白超家族成员 RNA干扰 人肝癌细胞系HepG2 -
慢病毒载体介导的人肝癌HepG2细胞BC047440基因沉默
目的 构建BC047440基因RNAi慢病毒干扰载体,并检测其对人肝癌细胞系HepG2细胞中BC047440基因的沉默效果.方法 针对已经筛选确定的BC047440基因 RNAi有效靶序列,合成BC047440基因特异性shRNA序列,退火形成双链DNA,与经HpaⅠ和XhoⅠ双酶切后的pFU-GW-iRNA载体连接产生pFU-GW-shBC047440慢病毒载体,PCR、DNA测序鉴定阳性克隆.用脂质体转染法将pFU-GW-shBC047440、pHelper 1.0载体和 pHelper 2.0载体共转染293T细胞,产生具备感染能力的慢病毒.以293T细胞中绿色荧光蛋白的表达水平测定病毒滴度,并测定其对人肝癌细胞株HepG2细胞适感染复数(MOI).以适MOI感染HepG2细胞,分BC047440-shRNA组、control-shRNA组和HepG2组;RT-PCR和 Western blot检测各组细胞 BC047440 mRNA及蛋白的表达差异.结果 经PCR鉴定,成功构建BC047440基因RNAi慢病毒载体.测定慢病毒滴度为5×108 TU/ml,其在HepG2细胞中适MOI为20;RT-PCR和Western blot检测结果分别显示 BC047440-shRNA组中 BC047440 mRNA及 BC047440蛋白表达较 control-shRNA组和 HepG2组明显降低,control-shRNA组与HepG2组间无明显差异.结论 成功构建BC047440特异性RNAi慢病毒载体,感染人肝癌细胞系HepG2细胞后,实现了对 HepG2细胞中BC047440基因的有效沉默.
关键词： BC047440 RNA干扰 慢病毒载体 人肝癌细胞系HepG2
