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流感病毒A/PR/8/34重配母本株高免疫原性HA蛋白制备及鉴定
制备流感病毒经典重配过程中所需的A/PR/8/34母本株血凝素蛋白(Hemagglutinin,HA)抗血清.A/PR/8/34流感病毒灭活纯化后经菠萝蛋白酶消化.5％～20％蔗糖连续密度梯度离心法纯化HA蛋白.单向免疫扩散法(Single Radial Immunodiffusion,SRID)筛选目的蛋白.SDS-PAGE法鉴定目的蛋白.纯化的A/PR/8/34 HA蛋白免疫兔子制备抗血清,血凝抑制试验(Hemoglutination Inhibition Assay,HI)测定HA抗血清效价,经SRID法鉴定HA抗血清纯度.成功制备了高免疫原性A/PR/8/34 HA蛋白;兔抗血清HI滴度可达10240,SRID法鉴定为高纯度HA抗血清.制备了流感病毒经典重配中关键试剂,摸索成功整套技术方法,为我国自主研发季节性流感疫苗株奠定了基础.
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2015-2016年度中国甲型H1N1亚型流感病毒疫苗候选株的制备及鉴定
目的 为获得2015-2016年度中国流行的甲型H1N1亚型流感病毒疫苗候选株,制备流感病毒重配株并对其进行鉴定.方法 采用经典重配的方法,将H1N1亚型流感病毒流行株与H3N2亚型的鸡胚高产重配母本株(X-157株)在鸡胚上进行混合培养.用H3亚型的HA蛋白抗血清和X-157株全病毒抗血清对混合培养病毒进行阴性筛选.阴性筛选后HA滴度较高的病毒用Real-Time PCR法对表面蛋白基因型进行鉴定.对表面蛋白基因型正确的毒株用限制性内切酶酶切鉴定法鉴定其内部基因组成.进一步对HA和NA基因进行Sanger法测序,并用表面基因无氨基酸位点突变的毒株免疫雪貂,进行双向血凝抑制(Two-way hemagglutination inhibition test,HI)试验.结果 Real-Time PCR筛选出5株表面蛋白基因型正确的毒株.经内部基因鉴定其中4株为6+2组成,1株为5+3组成.5株重配株的HA和NA基因均未发生氨基酸位点突变.5株重配株HA滴度均维持在1 024以上.终选取的12号重配株免疫原性良好,HI滴度达5 120,双向HI试验均通过.重配后疫苗株在鸡胚上的产量是重配前野毒株的64倍.结论 成功制备了2015-2016年度中国流行的甲型H1N1亚型流感病毒疫苗株,为疫苗贮备和疾病防控奠定了基础.
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流感病毒经典重配中X-157母本株HA抗血清制备
目的 制备流感病毒经典重配过程中所需的X-157母本株血凝素蛋白(Hemagglutinin,HA)抗血清.方法 X-157株流感病毒灭活纯化后经菠萝蛋白酶消化HA蛋白,蔗糖连续密度梯度离心法纯化,SDS-PAGE法鉴定纯化HA蛋白,免疫兔子收集抗血清,血凝抑制试验法(Hemoglutination Inhibition assay,HI)测定抗血清效价,单向免疫扩散法(Single Radial Immunodiffusion,SIRD)鉴定HA抗血清纯度.结果 成功制备了高免疫原性X-157株HA蛋白,兔抗HA血清HI滴度可达2560,SIRD鉴定为高纯度HA抗血清.结论 制备了流感病毒经典重配中关键试剂,摸索成功整套技术方法,为我国自主研发季节性流感疫苗株奠定了基础.
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重配技术构建高产H1N1型流感疫苗病毒株
目的 以经典重配技术制备高产H1N1流感疫苗病毒株.方法 以野生型A1/云南昆明/03/2009( H1N1)作为HA及NA基因的供体株,以WHO疫苗株A/Perth/16/2009( H3N2)作为高产基因供体株,共同感染SPF鸡胚,经抗H3及抗N2血清中和筛选法及终末稀释法筛选高产重配H1N1病毒.结果 获得一株重配H1N1流感病毒株,病毒血凝滴度为1∶4 096,病毒滴度为7.8 lg EID50/mL,显示为鸡胚高产病毒株；血凝抑制结果为1∶1024,单向免疫扩散试验结果为阳性,证明抗原性与野生株一致；基因测序结果表明重配株的HA及NA基因序列与野生株序列一致.结论 构建了高产重配H1H1流感疫苗病毒株,并应用经典重配技术建立了制备高产流感疫苗病毒株的技术平台.
