首页 > 文献资料
-
用表达T7RNA聚合酶细胞系拯救麻疹病毒微复制子
构建稳定表达T7RNA聚合酶的细胞系,用于提高拯救麻疹病毒微复制子效率.PCR扩增T7RNA聚合酶基因,克隆到真核表达载体,转染Vero细胞,用G418筛选到稳定表达的细胞株Vero/pcDNA3-T7.用Westernblotting证明了T7RNA聚合酶在细胞中的表达.将T7启动子控制绿色荧光蛋白表达的质粒转染该细胞后,绿色荧光蛋白在细胞株中得到表达.反向插入报告基因的微复制子转染感染麻疹病毒的Vero/pcDNA3-T7细胞后,细胞中能够检测到报告基因的表达.用细胞系取代痘苗病毒系统,可以提高拯救效率.
-
siRNA体外合成体系中GMP浓度优化及其对HeLa细胞端粒酶抑制的研究
目的 在小片段干扰RNA(short interfering RNA,siRNA)体外合成的反应体系中加入不同浓度的GMP,比较RNA转录效率的高低,探讨siRNA体外合成体系中GMP的佳浓度.并以该法合成的siRNA对肿瘤细胞端粒酶基因表达进行RNA干扰来验证其干扰效应.为简便、高效、低成本体外合成制备siRNA提供优化的实验条件,为广泛开展RNA干扰实验打下基础. 方法 以本实验室根据端粒酶hTERT基因(genebank gi:2347128)2653-2673位的核酸序列,构建的末端带T7启动子的部分双链DNA为模板,用T7RNA聚合酶体外合成方法合成siRNA.在siRNA体外合成的反应体系中加入不同浓度的GMP,以分光光度法测定合成的RNA量来比较RNA转录效率的高低;从而确定siRNA体外合成中GMP的佳浓度.并以磷酸钙共沉淀法将合成的siRNA转染Hela细胞.用TRAP-银染法和PCR-EIA分别检测siRNA转染后的Hela细胞端粒酶活性,以验证其干扰效应. 结果 在T7RNA聚合酶体外转录合成siRNA的反应体系中加入不同浓度的GMP,结果显示以GMP终浓度为5 mM时的RNA转录效率为佳.用该法合成的siRNA转染Hela细胞后端粒酶表达被抑制. 结论 GMP可提高T7RNA聚合酶体外转录体系的转录效率,本实验研究的反应体系中以5 mM GMP终浓度为其佳.以该优化法合成的针对端粒酶hTERT的siRNA对端粒酶的表达产生了干扰效应.
-
一种用于生物芯片荧光标记的线性扩增技术
荧光线性标记技术(Fluorescent linear labelling method)是一种有效、单试管、单一扩增的双色标记技术.样品RNA通过逆转录酶作用合成双链的cDNA,再应用T7RNA聚合酶合成cRNA,同时加入Cy3和Cy5标记的CTP,从而实现对核酸样品的标记.由于荧光线性标记技术可以实现对初始样品50～100倍的扩增,并且线性度较好,因此在生物芯片实验的样品标记领域具有重要的应用价值.
