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丹参雄性不育与可育近等基因系差异片段的发掘
利用雄性不育系培育新品种和生产杂种一代,在产量、品质等方面均具有独特优势.前期课题组已通过多代连续杂交获得丹参雄性不育与可育近等基因系.该文在前期工作基础上采用AFLP和BSA技术对378对引物进行筛选,发现7对引物和26个标记与丹参育性调控基因紧密连锁,由此构建出连锁遗传图谱.以前期发现的E11/M4-208标记为模板,运用染色体步移技术,在不育和可育系中分别扩增出2 028,2 027 bp的差异片段,发现4个突变碱基位点均处于内含子中.在所有差异标记中发现E01/M09-418,E05/M13-308,E05/M04-750,E01/M01-204 4个与丹参育性调控基因紧密连锁的标记,与拟南芥1,3,5号染色体相似性达100％.其中与育性调控基因距离很近(2.1 cM)的E01/M09-418与同处于拟南芥第3号染色体的核不育基因MS2相似度高达100％.不育系中获得的2 028 bp片段与MS2基因在两处相似度达100％.与拟南芥第5号染色体相似度100％的E05/M04-750,与杨树POP085-M05基因和拟南芥中低亲和力钙逆向转运蛋白序列具有较高相似性,且E非常低.该文遗传图谱的构建和功能性差异序列的发现,为后续准确锚定丹参基因组中育性调控基因及揭示其功能奠定了坚实基础.
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应用SEFA-PCR扩增刺五加内生青霉鲨烯合酶基因的旁邻序列
①目的 克隆刺五加内生青霉Penicillium minioluteum P116-1a鲨烯合酶(squalene synthase,SS)基因的旁邻序列.②方法 根据已经获得的P.minioluteum P116-1a SS DNA序列设计特异性性引物,采用SEFA-PCR(self-formed adaptor PCR)扩增其3'和5'末端未知序列.③结果 3'末端扩增获得长约5 000 bp的片段,5'末端扩增获得长约3 000bp的片段.④结论 首次应用SEFA-PCR技术扩增获得P.minioluteum P116-1a SS基因的末端序列,为进一步研究该基因对刺五加皂苷含量的作用机制奠定了基础.
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紫草LePS-2基因启动子的克隆及序列分析
目的 克隆紫草LePS-2基因的启动子,分析该启动子的调控元件,为研究LePS-2基因的表达调控机制奠定基础.方法 以紫草愈伤组织基因组DNA为模板,利用Genome walking技术扩增LePS-2基因上游启动子序列,将序列提交至PLACE网站对该启动子进行调控元件预测.结果 获得LePS-2基因启动子区域序列1164bp,PLACE软件分析表明,该启动子中存在根特异性元件、暗诱导性元件、激素应答与调节相关元件以及一些转录因子结合位点等.结论 启动子元件ATATT和YTCANTYY可能分别赋予LePS-2表达的根特异性和暗诱导性;另外在LePS-2基因启动区域还发现MJ应答元件TGACG,表明MJ有可能参与对LePS-2的表达调控.
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锅柄聚合酶链反应法扩增贵阳腐霉 Pr1基因上游未知序列
目的：在灭蚊真菌贵阳腐霉Pr1基因已知序列的基础上，利用锅柄聚合酶链反应法扩增Pr1基因上游未知序列。方法首先采用限制性内切酶BamHⅠ对基因组DNA进行完全酶切，用小牛肠碱性磷酸酶去磷酸化后，与5′磷酸化的寡核苷酸链连接，经过变性、链内退火和聚合酶延伸形成锅柄状，后进行嵌套式PCR。结果获得了Pr1基因已知序列上游864bp核苷酸序列，GenBank登录号为：JQ975036。结论锅柄聚合酶链反应法可以高度有效地扩增与已知位点相邻的基因组片段，是一种可靠的染色体步移法，有利于Pr1基因全长的克隆。
