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基于单一基因的反转录-环介导等温核酸扩增技术快速检测甲型副伤寒沙门菌
目的 建立反转录-环介导等温核酸扩增(RT-LAMP)方法特异检测甲型副伤寒沙门菌.方法 针对甲型副伤寒沙门菌特异保守hsdM基因设计引物,通过优化反应条件,建立检测该靶基因的RT-LAMP体系.利用多种血清型沙门菌及非沙门菌菌株DNA评价该方法的特异性及敏感性.同时对甲型副伤寒沙门菌全血模拟标本及粪便模拟标本进行敏感性检测,并利用临床样本进行初步验证.结果 等温65℃条件下,30～60 min内完成RT-LAMP反应,利用该方法检测130株甲型副伤寒沙门菌均为阳性,其他非甲型副伤寒沙门菌均扩增阴性.对纯菌RNA检测中检测下限为50 pg/反应,约为19 000个拷贝/反应.在以全血模拟样本的检测中,敏感性达80 cfu/ml,略高于PCR检测低限.对粪便模拟标本的检测中,对原始样品检测下限为500 cfu/g;增菌后样品检测下限为0.8 cfu/g,比PCR检测低限高2～10倍.临床样本中甲型副伤寒患者血液标本检测均阳性,而伤寒样本检测均阴性.结论 建立了敏感性高、特异性好的检测甲型副伤寒沙门菌的RT-LAMP方法,为甲型副伤寒沙门菌感染的快速诊断提供了简易手段,可试用于甲型副伤寒的早期诊断.
关键词： 甲型副伤寒沙门菌 反转录-环介导等温核酸扩增技术 甲型副伤寒 -
全血中伤寒沙门菌RT-LAMP检测方法的建立
目的 建立反转录-环介导等温核酸扩增(RT-LAMP)方法特异检测伤寒沙门菌.方法 针对伤寒沙门菌fliC-d基因设计6条特异性引物,通过优化反应条件,建立检测该靶基因的RT-LAMP方法,利用48个血清型的纯培养伤寒和非伤寒沙门菌菌株、常见非沙门致腹泻病原菌以及发热为主要症状的8种常见病原菌RNA评价该方法的特异性及敏感性,同时对伤寒沙门菌全血模拟标本进行敏感性检测,并与rRT-PCR方法的敏感性进行比较.结果 等温65℃条件下,30～60 min内可完成RT-LAMP检测反应,利用该方法检测44株伤寒沙门菌均阳性,除4种少见的非伤寒沙门菌血清型扩增阳性外,其余30种非伤寒沙门菌血清型、致腹泻的其他5种肠道致病菌以及发热为主要症状的8种常见非沙门菌也均扩增阴性.在对纯菌总RNA检测中,RT-LAMP的低检测限为0.5 pg/反应,即97个拷贝/反应.在以全血模拟样品提取核酸为模板的检测中,敏感性达1 cfu/ml,比rRT-PCR检测低限高100倍.结论 建立了敏感性高、特异性好的RT-LAMP检测血液中伤寒沙门菌的方法,为伤寒沙门菌感染的快速诊断及不明原因发热症状的病原初步鉴别提供了简便的手段,可用于对伤寒的早期诊断、预防控制及临床治疗.
关键词： 伤寒沙门菌 反转录-环介导等温核酸扩增技术 伤寒
