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金欣口服液对呼吸道合胞病毒感染的小鼠肺泡巨噬细胞TLR7信号转导通路的影响
目的:研究金欣口服液含药血清对呼吸道合胞病毒(RSV)感染的小鼠肺泡巨噬细胞(RAW264.7) Toll样受体7(TLR7)信号转导通路的影响,探讨其可能的抗病毒机制.方法:RSV感染培养的RAW264.7细胞,用金欣口服液含药血清进行干预,24h后收集细胞及上清液,Western Blot法检测RAW264.7细胞TLR7、髓样分化因子-88(MyD88)、核因子(NF-кB)、干扰素调节因子7(IRF7)蛋白表达,ELISA法检测细胞上清液肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-α(IFN-α)的含量.结果:金欣口服液含药血清能降低RSV感染24h后TLR7、MyD88、NF-кB蛋白表达水平(P＜0.01,P＜0.05),而对IRF7的表达无明显的影响;下调细胞上清液中的TNF-α表达(P＜0.01),IFN-α未能测出.结论:金欣口服液含药血清可能通过抑制TLR7/MyD88/NF-кB/TNF-α通路发挥抗RSV作用.
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银花平感颗粒的体外抗甲型H1N1流感病毒作用
目的 探讨银花平感颗粒体外抗甲型A/PR8/34 (H1N1)流感病毒的作用机制.方法 采用MTT比色法测定药物对巨噬细胞的大无毒浓度(TC0),半数细胞毒性浓度(TC50)及药物不同给药方式的抗病毒有效率,采用Probit回归分析计算其对病毒感染的半数抑制浓度(IC50)及治疗指数(TI);流感病毒H1N1感染培养的RAW264.7细胞,用利巴韦林(62.5 μg/ml),银花平感颗粒高(500 μg/ml)、中(250 μg/ml)、低(125 μg/ml)各剂量进行干预,4、16、24h后收集细胞,实时荧光定量PCR法观察各组细胞中Toll样受体7(TLR7)、髓样分化因子88 (MyD88)、核因子p65(NF-κB p65)、干扰素调节因子7(IRF7)的变化. 结果 银花平感颗粒在31.25 ～ 500 μg/ml范围内可降低流感病毒复制,其中药物治疗组在给药24 h后,抗病毒有效率高;与正常对照组同时间比较,模型对照组TLR7、MyD88、IRF7、NF-κBp65 mRNA表达水平均显著升高,且16h达高峰,较本组4h、24h差异均有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01);经药物干预后,银花平感颗粒高、中剂量组及利巴韦林组均显著下调流感病毒诱导4、16、24 h后的TLR7、MyD88、IRF7和NF-κB p65 mRNA表达水平(P＜0.05或P＜0.01),尤以银花平感颗粒高剂量组对TLR7、MyD88和NF-κB p65 mRNA表达水平的下调作用较利巴韦林组更为显著(P＜0.05). 结论 银花平感颗粒体外可明显抑制流感病毒复制,主要是通过治疗给药而发挥抗病毒作用,其抗病毒效果可能与其抑制TLR7/MyD88/IRF7信号通路及NF-κB p65的激活有关,且高剂量对流感的治疗效果优于利巴韦林.
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小鼠肺泡巨噬细胞中腺苷酸活化蛋白激酶参与内毒素诱导炎症因子分泌的调控
目的 探讨腺苷酸活化蛋白激酶( AMP-activated protein kinase, AMPK)在小鼠肺泡巨噬细胞由脂多糖( lipopolysaccharide,LPS)诱导炎症因子分泌中的作用机制. 方法 选择野生型和AMPKα1-/-小鼠原代肺泡巨噬细胞,ELISA(酶联免疫吸附剂测定)方法检测在有无AMPK的激动剂[5-氨基-4-甲酰胺咪唑核糖核苷酸(5-amino-1-β-D-ribofuranosyl-imidazole-4-carboxamide,AICAR)]作用下LPS刺激的细胞上清中肿瘤坏死因子-α( TNF-α)、白细胞介素-1β( IL-1β)分泌;Western blot方法检测AMPKα1、α2在野生型和AMPKα1-/-小鼠肺泡巨噬细胞中的表达, LPS作用下p-AMPKα活性变化. 结果 AMPKα1-/-小鼠肺泡巨噬细胞中LPS刺激的炎症因子分泌显著高于野生型;野生型小鼠肺泡巨噬细胞LPS下调p-AMPKα活性, AICAR显著抑制LPS诱导的TNF-α、IL-1β的分泌. 结论AMPKα1缺失促进了LPS诱导的炎症因子分泌,AMPK激动剂AICAR显著抑制LPS诱导的炎症因子分泌,AMPK参与了小鼠肺泡巨噬细胞中内毒素诱导的炎症因子分泌调控.
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小鼠肺泡巨噬细胞的分离及鉴定
目的 分离小鼠肺泡巨噬细胞(alveolar macrophage,AM),并鉴定其纯度和吞噬活性.方法 采用肺泡灌洗法分离小鼠AM,分别通过瑞氏-姬姆萨染色法和Diff-Quik染色法鉴定AM的纯度;将FITC标记的大肠埃希菌与AM按不同比例混合(10∶1、15∶1、20∶1)后孵育不同时间(20、25、30 min),荧光倒置显微镜下观察AM的吞噬活性.结果 两种染色方法染色时,阳性细胞百分率均在94％以上,Diff-Quik染色法细胞阳性率略高于瑞氏-姬姆萨染色法,染色时间较瑞氏-姬姆萨染色法短,且背景干净无杂质.小鼠AM的吞噬率和吞噬指数随着FITC标记的细菌与AM比例的增加而增大,且随孵育时间的延长呈先升高再降低的趋势.当细菌与细胞比例为20∶1,孵育时间为25 min时,吞噬率和吞噬指数达大,分别为(63.67±4.04)％和1.41±0.07.结论 贴壁培养法可获得较高纯度的小鼠AM,Diff-Quik染色法鉴定巨噬细胞纯度优于瑞氏-姬姆萨染色法,其可代替瑞氏-姬姆萨染色法,成为一种快速、高效的鉴定巨噬细胞纯度的方法.
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马尔尼菲青霉菌感染对小鼠肺泡巨噬细胞极化的影响
目的:研究马尔尼菲青霉菌(PM)感染诱导小鼠肺泡巨噬细胞极化的免疫反应类型.方法:以30只雄性BALB/c小鼠为实验对象,随机分为空白对照组、感染2周组、感染4周组,每组10只.麻醉处死各组小鼠后获取小鼠肺泡巨噬细胞,以每孔1×106个细胞培养24 h后收集细胞上清和细胞沉淀.分别以qRT-PCR和酶活性定量方法检测精氨酸代谢关键酶及其活性的表达;以ELISA检测IL-12、TNF-α和IL-10的分泌.结果:感染2周组较空白对照组高表达经典途径激活型巨噬细胞(M1)的标志[诱导性一氧化氮合酶(iNOS) mRNA、NO、IL-12、TNF-α]和替代途径激活型巨噬细胞(M2)的标志[精氨酸酶(Arg1) mRNA、尿素](P＜0.05).以上指标在感染4周后均明显下降,感染4周组iNOS mRNA、Arg1 mRNA和尿素的表达仍比空白对照组高(P＜0.05);感染4周组NO、IL-12和TNF-α的表达下降至空白对照组水平或者比空白对照组水平更低.IL-10在各组的表达与空白对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论:感染PM 2周时可以明显促进小鼠肺泡巨噬细胞向M1型及可能向M2型巨噬细胞转变,在感染4周时有明显下降趋势.
