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ISSR分子标记快速预测远志中sibiricose A5和sibiricose A6的含量
目的:优化远志简单重复序列区间(ISSR)扩增多态性反应体系,设计一对聚合酶链式反应(PCR)引物用于快速预测远志药材中sibiricose A5和sibiricoseA6的含量高低.方法:采用UPLC测定远志药材中sibiricose A5与sibiricose A6的含量,通过单因素试验优化远志ISSR反应体系,利用ISSR分子标记技术筛选出与sibiricose A5和sibiricose A6含量相关的特异性DNA片段,针对此片段设计特异性PCR引物.结果:7批远志药材中sibiricose A5和sibiricose A6的含量差异较大,变化范围分别为0.895 4 ～3.227 6,0.6442～2.0578 mg·g-1.对筛选出的与sibiricose A5和sibiricose A6含量相关片段(890-8)进行克隆测序后,设计出了1对特异性引物(YZ-SA),可用于快速预测远志药材中sibificose A5和sibiricose A6的含量高低.结论:优化后的远志ISSR反应体系具有标记位点清晰、检测多态性能力强等特点,设计出的特异性引物可用于快速预测远志药材中sibiricose A5和sibiricose A6的含量高低.
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一种随机引物联合多特异性DNA片段检测结核分支杆菌的新方法
目的:针对目前结核性疾病实验室诊断的局限性,探索一种更为敏感和特异的结核分枝杆菌DNA检测新方法.方法:选取10株江苏地区流行的结核分支杆菌(MTB)菌株,选取临床其他常见菌株及分枝杆菌菌株作为对照组,分别提取DNA作为随机引物的模板.参考国内、外文献设计12条随机引物,并分别对MTB及对照菌株进行单个引物随机扩增,2％的琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行分离并切胶纯化,通过TA克隆将纯化片段连接到质粒pEASYTM-T5 Zero并进行测序,通过BLAST-nr比对验证是否为MTB DNA片段.按照所确定的MTB片段序列,在其内部设计、合成一对特异性引物.用此特异性引物扩增对应的随机引物扩增产物,获得MTB特异性条带图谱.并将该方法检测的敏感性和特异性与临床上常用的real-time PCR进行比较.结果:经BLAST-nr比对,随机引物IS986F,S535及IS986R扩增的条带与MTB DNA有高度同源性(均为99％).随机引物IS986F、S535和IS986R分别联合其特异性引物可以检测稀释105倍、105倍和103倍的MTB DNA,其特异性分别为100％、90％和80％.常规real-time PCR可检测出稀释104倍的MTB DNA.结论:随机引物IS986F联合其特异性引物检测结核分枝杆菌的灵敏度和特异性优于S535、IS986R两组,特异性为100％,且灵敏度优于常规real-time PCR法.
