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大鼠"京骨"和"大钟"原络配穴的神经解剖学基础——霍乱毒素亚单位B结合荧光素488和594双标法
目的:用霍乱毒素亚单位B结合荧光素488和594(cholera toxin subunit B conjugated with Alexa Fluor 488,594,CTB-Alexa 488,594)双标记示踪技术揭示"京骨"和"大钟"穴在大鼠神经系统中的特异性联系,探讨原络配穴的神经解剖学基础.方法:用微量注射器将0.1%CTB-Alexa 488和CTB-Alexa 594两种示踪剂各5 μL分别注入3只雄性SD大鼠后肢"京骨"和"大钟"穴区.72 h后将动物灌流固定,取出脑、脊髓和脊神经节,并制成组织切片,然后直接用荧光显微镜系统观察和记录被标记的神经元.结果:在相应的激发光下,CTB-Alexa 488和594标记的神经元分别呈绿色和红色,双重标记的神经元呈黄色,均位于示踪剂注入侧的相关神经组织中.在所标记到的神经元中,与"京骨"和"大钟"穴相关联的感觉神经元集中在L4～ L5脊神经节,少量分布在L3和L6脊神经节,其中双标的感觉神经元主要出现在L4～L5脊神经节;与两穴相关联的运动神经元以L4～L5节段为中心呈柱状分布在L3～L6节段脊髓前角第IA层的后外侧部.结论:应用CTB-Alexa 488和594荧光双标记示踪技术观察到了与原穴"京骨"和络穴"大钟"相关的感觉和运动神经元在脊神经节和脊髓的分布规律.
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共聚焦激光扫描显微镜研究大鼠脑缺血谷氨酸载体GLAST mRNA和EAAT1的表达与其细胞分布
目的:通过应用共聚焦激光扫描显微镜技术(confocal laser scanning microscope, CLSM)观察脑缺血后谷氨酸载体GLAST mRNA和EAAT1蛋白表达的细胞定位,探讨CLSM技术中三维重建和三维显示在观察基因和蛋白在神经细胞上空间定位的应用.方法:对脑缺血后采用原位杂交和免疫组织化学相结合的荧光双标技术标记的脑片进行双通道断层扫描以及三维数据重组.结果:脑缺血后,荧光免疫组化双标显示大脑皮质缺血半暗区内的谷氨酸载体EAAT1蛋白与星形胶质细胞和神经元均有共表达;原位杂交结合免疫组化的荧光双标显示缺血周边区谷氨酸载体GLAST mRNA与星形胶质细胞和神经元有明显的共表达.结论:共聚焦激光扫描显微镜观察脑缺血后谷氨酸载体GLAST mRNA和EAAT1蛋白在神经胶质细胞和神经元上的空间定位,为进一步研究脑缺血后谷氨酸载体系统作用机制提供了更为准确的形态依据.
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成年鼠缺血性脑损伤诱导nestin的表达
应用免疫组化和免疫荧光双标技术结合激光共聚焦扫描显微镜, 观察缺血性脑损伤后脑内nestin的表达及其细胞类型.实验观察结果为, 再灌后1天, 在缺血中心区可见nestin阳性突起; 再灌后3天和1周时,除缺血中心区外,周边Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ区均有nestin大量表达; 而2周时仅限于周边Ⅰ区大量表达.激光共聚焦扫描显微镜观察到,再灌后3天, 周边Ⅰ区nestin阳性突起主要与GFAP共存; 2周时,nestin阳性突起变粗、变长,并与NSE的共存明显增多.上述研究结果提示,脑缺血可诱导大鼠脑缺血区域表达nestin,该表达可能与神经细胞的修复有关.
关键词： 脑缺血 荧光双标 激光共聚焦扫描显微镜 巢蛋白 (nestin) -
钛合金、人工骨材料厚切片再研磨后显示新生骨-荧光双标法
因钛合金、人工骨材料组织坚硬,无法切出较薄的完整切片.传统方法切片只能看到骨结构,V-G染色法镜下观察切片颜色不鲜亮,细胞核模糊,软骨和纤维结缔组织很难辨别,荧光双标两条线不够清晰,只能采集低倍图片.本文现介绍一种新方法,用502胶粘贴于有机玻片上,再经自制电动磨片机研磨至30～ 50 μm厚,用Van Gieson(亚甲基兰-酸性品红,简称V-G)染色,颜色对比鲜艳,高倍镜下骨细胞核、软骨、纤维结缔组织等均可清晰辨别.四环素-钙黄绿素荧光双标更为清晰[1-3].
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成年大鼠液压冲击脑损伤诱导室下区Nestin和GFAP的表达
目的应用免疫组织化学和免疫荧光双标技术结合激光共聚焦显微镜,观察脑损伤后不同时期室下区巢蛋白(Nestin)和胶质酸性纤维蛋白(GFAP)的表达及其细胞类型.方法用动液压冲击法建立动物模型,用LeicaQ500IW图像处理系统及免疫组化和免疫荧光双标法分析和显示不同时期(1、3、5d, 1、2、3、4、6、8周)Nestin和GFAP的表达变化.结果损伤24h后,室下区有大量Nestin和GFAP的表达,且激光共聚焦显微镜观察到有Nestin阳性突起与GFAP共存现象, 7d左右达到高峰,然后随着时间的推移其表达逐渐下降.正常组和假手术组,室下区也可见到Nestin和GFAP的表达,但与脑损伤组相比较低(P<0.05).结论脑损伤可诱导室下区Nestin和GFAP的表达, Nestin阳性突起与GFAP共存细胞可能具有干细胞特性,与神经元的修复有关.
