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小鼠黏蛋白1(MUC1)基因的体外转录及其在NIH/3T3细胞中的表达
目的 体外转录获得小鼠黏蛋白1(MUC1) mRNA并在NIH/3T3细胞中表达.方法 通过反转录PCR从小鼠4T1细胞中扩增MUC1基因,然后插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中构建重组表达载体pcDNA3.1(+)-MUC1.双酶切鉴定正确后,以该质粒为模板,下游引物中引入血凝素标签(HA TAG)序列,PCR扩增MUC1-HA TAG融合基因片段,然后克隆至表达载体pcDNA3.1(+),重组载体经双酶切鉴定和DNA序列测定后作为模板,PCR扩增获得含T7启动子和MUC1-HA TAG融合基因片段的PCR产物作为体外转录模板,通过体外转录、加尾、纯化终获得修饰的MUC1 mRNA.通过多种转染试剂将体外转录MUC1-HA TAG mRNA转入NIH/3T3细胞,Western blot法检测融合蛋白MUC1-HA TAG的表达.结果 反转录PCR扩增的MUC1基因长度约为1900 bp,酶切鉴定和序列分析证实MUC1-HA TAG融合基因已成功插入pcDNA3.1(+)质粒.插入序列与GenBank中小鼠的MUC1基因序列完全一致,HA TAG正确插入MUC1下游,读框正确.Western blot法分析证实体外转录修饰的MUC1-HA TAG mRNA能在NIH/3T3细胞中表达.结论 体外转录修饰的小鼠MUC1-HA TAG mRNA能在哺乳动物NIH/3T3细胞中翻译表达.
关键词： 黏蛋白1 (MUC1) 体外转录 蛋白表达 -
CpG联合MUC1增强人外周血树突状细胞功能的实验研究
目的：观察CpG联合黏蛋白1（MUC1）应用对树突状细胞（DC）刺激T细胞增殖作用的影响。方法：应用淋巴细胞分离液分离人外周血单核细胞，体外培养应用GM－CSF、IL－4、TNF－α等细胞因子诱导DC，观察细胞形态，并通过流式细胞术检测细胞标志物CD80、CD86。收获DC按如下分组：A：DC；B：DC＋CpG；C：DC＋MUC1；D：DC＋CpG＋MUC1；E：CpG＋MUC1，分别与T淋巴细胞混合培养，通过MTT法检测T细胞增殖情况。结果：DC表型检测结果为：CD80＋细胞占70．4％，CD86＋细胞占72．0％，呈现成熟DC表型。MUC1与DC联合疫苗与淋巴细胞混合培养显示：DC具有刺激T细胞增殖的作用，CpG＋DC组和MUC1＋DC组，分别较单纯DC组对T细胞的刺激增殖作用明显增强（P＜0．01），DC＋CpG＋MUC1组又明显高于单用MUC1或CpG＋DC组，差别显著（P＜0．01），单纯加CpG和MUC1（无DC组）则基本无明显刺激T细胞增殖作用。结论：CpG联合MUC1能明显提高DC促T细胞增殖的功能。
关键词： CpG 黏蛋白1 (MUC1) 树突状细胞(DC)
