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膀胱平滑肌细胞条件培养液诱导脐带MSCs向平滑肌细胞分化的实验研究
目的 探讨膀胱平滑肌细胞(bladder smooth muscle cells,BSMCs)条件培养液能否诱导脐带MSCs(umbilical cord MSCs,UCMSCs)向平滑肌细胞(smooth muscle cells,SMCs)分化,为组织工程技术应用于泌尿系统修复重建寻找可供选择的种子细胞. 方法 取足月新生儿脐带和行膀胱全切术患者捐赠的正常膀胱组织,分别分离培养UCMSCs和BSMCs.收集第1～～5代BSMCs的培养液,与完全培养基以1∶1比例配制成BSMCs条件培养液.取第3代UCMSCs作为诱导细胞,使用BSMCs条件培养液培养为诱导组(A组),完全培养基培养为对照组(B组),倒置显微镜观察两组细胞形态变化;另设单纯BSMCs为阳性对照组(C组).培养7、14d,采用免疫荧光染色和Western blot检测各组细胞中α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、Calponin、平滑肌肌球蛋白重链(smooth muscle myosin heavy chain,SM-MHC)的表达情况. 结果 诱导培养后,A组细胞逐渐变长,由短棒状、多个突起逐渐转变为长梭形,与BSMCs形状相似;B组细胞形态未见明显变化.免疫荧光染色示,C组BSMCs中α-SMA、Calponin和SM-MHC均呈阳性表达.培养7d,A、B组可见α-SMA呈阳性表达;14d时,A组α-SMA阳性表达逐渐增多,B组无明显变化.培养7d,A组可见Calponin阳性表达,14d时阳性表达明显增多;B组各时间点均未见Calponin阳性表达.各时间点A、B组均未见SM-MHC阳性表达.Western blot检测示各组细胞α-SMA、Calponin和SM-MHC蛋白表达情况与免疫荧光染色结果基本一致. 结论 BSMCs条件培养液能诱导UCMSCs向SMCs分化,UCMSCs有望成为泌尿系统修复重建可供选择的种子细胞之一.
关键词： 脐带MSCs 膀胱平滑肌细胞条件培养液 平滑肌细胞 诱导分化 -
大鼠脐带华通胶来源MSCs修复脊髓损伤的实验研究
目的 观察大鼠脐带华通胶来源MSCs(umbilical cord MSCs,UCMSCs)体外培养特性及其对大鼠脊髓损伤(spinal cordinjury,SCI)后神经再生的作用.方法 取足天Wistar孕鼠脐带分离、培养UCMSCs,体外扩增并采用流式细胞仪鉴定.细胞移植前1 d取第5代细胞以Hoechst 33258染液标记,调整终浓度为1×10~5个/μL备用.另取成年雌性Wistar大鼠60只,体重(300 ±10)g,随机分为3组,每组20只.A、B组以Impactor model-Ⅱ型打击器制备大鼠T~(10)SCI模型,并分别于损伤区注射1 μL标记后的细胞悬液和等量DMEM培养液;C组行单纯椎板减压,不予脊髓打击及治疗措施.于术后1 d,1、2、3、4、5、 6周,采用BBB评分法行肢体功能评分;术后6周行神经丝蛋白200(neurofilament 200,NF-200)免疫组织化学染色观察细胞分化情况;术后10周行生物素葡聚糖胺(biotinylated dextran amine,BDA)顺行示踪观察皮质脊髓柬(corticospinal tract,CST)再生情况.结果 培养的UCMSCs为梭形细胞,呈漩涡状或平行贴壁生长.流式细胞仪检测显示,UCMSCs表达CD29,不表达CD31、CD45及HLA-DR.术后A、B组BBB评分均明显上升,3周后A组BBB评分明显高于B组,差异有统计学意义(P<0.05);各时间点A、B组评分均低于C组(P<0.05).术后6周,荧光显微镜观察可见Hoechst 33258染液标记的UCMSCs存活并向损伤区聚集;A、C组NF-200免疫荧光染色阳性面积分别为(11 943±856)像素及(13 117±945)像素,明显高于B组的(7986 ±627)像素,差异有统计学意义(P<0.05):A、C组差异无统计学意义(P>0.05).BDA顺行神经示踪观察显示,术后10周A组部分CST再生神经纤维可延伸至损伤区远端;B组神经纤维极少通过损伤空洞;C组CST纤维在对侧脊髓白质后索中行走.A、B组各点再生轴突数与T_5横断面阳性染色轴突百分比与C组比较,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 UCMSCs能在体外快速增殖,移植后在大鼠SCI部位存活并向神经细胞分化,可有效促进SCI后运动功能恢复和神经轴突再生.
