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重组腺病毒r-caspase3的靶向性实验研究
目的:观察构建靶向性反向半胱氨酸蛋白酶3(r-caspase3)重组腺病毒对AFP表达阳性肝癌细胞凋亡诱导的效果和特异性.方法:采用AFP表达强阳性细胞HepG2、表达弱阳性细胞7721、正常肝细胞L-02以及AFP表达阴性乳腺癌细胞 MDA-MB-231,分别感染构建之重组腺病毒Ad-r-caspase3、Ad-E(AFP)P(ALB)/r-caspase3及Ad-P(ALB)/r-caspase3,SRB染色测定O.D值,计算细胞死亡率和IC50;流式细胞术检测细胞凋亡指数.结果:HepG2、7721细胞对各腺病毒敏感程度为Ad-E(AFP)P(ALB)/r-caspase3>Ad-PALB/r-caspase3>Ad-r-caspase3;流式细胞术检测结果显示重组腺病毒Ad-E(AFP)P(ALB)/r-caspase3具有极强的凋亡选择性,AFP表达越强,凋亡指数越高.结论:靶向性 Ad-E(AFP)-P(ALB)/r-caspase3重组腺病毒具有肝细胞性肝癌凋亡选择性,同AFP表达呈正相关.
关键词： 癌 肝细胞 腺病毒 反向半胱氨酸蛋白酶3基因 靶向性 -
肝细胞肝癌靶向性r-Caspase-3重组腺病毒的构建与表达
目的 构建肝细胞肝癌特异性表达反向半胱氨酸蛋白酶3(r-Caspase-3)重组腺病毒,为肝细胞肝癌的基因治疗提供新策略.方法 构建甲胎蛋白(AFP)增强子和白蛋白 (ALB) 启动子腺病毒载体(pAdTrack-EAFP-PALB),然后将目的 基因r-Caspase-3亚克隆到载体pAdTrack-EAFP-PALB上, 获得重组腺病毒穿梭载体pAdTrack-EAFP-PALB /r-Caspase-3, 经PmeⅠ酶切线性化后与pAdEasy-1同源重组,获得重组腺病毒骨架pAdEasy-EAFP-PALB /r-Caspase-3; 鉴定正确的pAdEasy-EAFP-PALB /r-Caspase-3 经PacⅠ酶切线性化后脂质体转染AD293 细胞进行包装、扩增,获得病毒.绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)监测病毒滴度和感染效率; RT-PCR和Western blot 法检测r-Caspase-3在HepG2细胞中的表达; SRB染色法评估重组腺病毒对HepG2细胞的抑制作用,初步观察HepG2细胞凋亡状况.结果 穿梭载体pAdTrack-EAFP-PALB/r-Caspase-3酶切、测序正确.穿梭载体、pAdEasy-1载体同源重组后PCR 及PacⅠ酶切鉴定结果表明pAdEasy-EAFP-PALB/r-Caspase-3 重组成功; 经PacⅠ酶切线性化后,pAdEasy-EAFP-PALB/r-Caspase-3 转染AD293 细胞即可观察到GFP 的表达; 回收病毒可重复感染AD293 细胞,RT-PCR和Western blot 均可检测到r-Caspase-3的表达,证实Ad-EAFP-PALB/r-Caspase-3病毒颗粒包装成功; SRB染色检测发现Ad-EAFP-PALB/r-Caspase-3具有凋亡诱导特异性.结论 靶向性Ad-EAFP-PALB/r-Caspase-3重组腺病毒构建成功,并具有凋亡诱导靶向性,为进一步研究靶向性r-Caspase-3基因治疗肝细胞肝癌及其生物学功能奠定了基础.
关键词： 腺病毒 反向半胱氨酸蛋白酶3基因 靶向性 肝细胞肝癌
