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RNA干扰GCF2基因沉默对人肝癌BEL-7404细胞侵袭能力的影响
目的 探讨沉默GCF2基因表达对人肝癌BEL-7404细胞侵袭能力的影响.方法 实验分为GCF2-siRNA组、NC-siRNA组及MOCK组,GCF2-siRNA组转染靶向GCF2基因的RNA干扰序列GCF2-siRNA,阴性对照组转染阴性对照序列NC-siRNA,MOCK组不转染任何序列.将靶向GCF2基因的RNA干扰序列 (GCF2-siRNA) 瞬时转染BEL-7404细胞以沉默GCF2表达,采用CCK-8法检测细胞增殖活性,体外侵袭实验检测细胞侵袭能力,Western blot检测基质金属蛋白酶(MMP)-9及GCF2靶基因MMP-23蛋白表达.结果 转染GCF2-siRNA使GCF2表达下调,后者导致BEL-7404增殖受阻;GCF2-siRNA组的穿膜细胞数较阴性对照组(NC-siRNA)及未转染组(MOCK)明显减少(穿膜细胞数分别为41.5±0.95、61.3±1.57、64.5±1.65,P<0.05);MMP-9和MMP-23蛋白表达较两个对照组明显下降(P<0.05).结论 下调GCF2表达能抑制BEL-7404侵袭能力, 提示GCF2促进肝癌细胞的侵袭可能是其参与肝癌发展进程的重要途径.
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肿瘤相关抗原GCF2高水平表达的肝癌细胞株的筛选
目的 筛选出肿瘤相关抗原GCF2高表达的人肝癌细胞株,为进一步探讨GCF2对肝癌发生发展的可能作用奠定基础.方法 选择4种人肝癌细胞株(BEL-7404、HepG2、SMMC-7721和QGY-7703)及1种成人正常肝细胞株(HL-7702),培养后分别制作细胞爬片及提取蛋白后,采用免疫细胞染色技术和Western blot的方法筛选出GCF2表达量高的细胞株.结果 免疫细胞染色显示,GCF2在5种细胞中的胞核及胞质中均有表达.GCF2蛋白在肝癌细胞BEL-7404、HepG2、SMMC-7721和QGY-7703的表达要强于正常肝细胞HL-7702,其中以BEL-7404的表达量高.通过Western blot检测,BEL-7404的GCF2相对表达量为0.875±0.134,较其他细胞株高,差异有统计学意义(P<0.05).结论 BEL-7404细胞中GCF2蛋白水平的相对表达量高,可以作为下一步探讨GCF2在肝癌发生发展的可能作用的实验材料.
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GCF2选择性剪接区在肝癌组织及细胞株中的表达及意义
目的:研究肿瘤相关抗原GCF2选择性剪接区在人肝癌细胞株、肝癌组织、癌旁组织及正常成人肝细胞及组织中的表达及意义.方法:采用RT PCR检测GCF2 5个选择性剪接区(D1～D5)在人肝癌细胞株、43例肝癌组织、相对应的癌旁组织,以及正常成人肝细胞株及9例肝组织中的表达.结果:GCF2 4个选择性剪接区(D1～D4)在所检测的细胞株、肝癌组织、癌旁组织和正常成人肝组织中均未检测到表达;GCF2选择性剪接区D5仅在人肝癌细胞株检测到阳性表达;在43例肝癌组织及相应的癌旁组织中,有41例肝癌组织GCF2选择性剪接区D5呈阳性表达,阳性表达率为95.35％ (41/43),而9例正常肝组织均未检测到GCF2选择性剪接区D5表达.结论:GCF2 D5选择性剪接区在肝癌组织中有较高阳性表达,GCF2选择性剪接区D5可能与肝癌的发生发展有关.
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GC结合因子2在肝细胞癌中的表达和意义
目的:探讨转录因子GC结合因子2(GC binding factor 2,GCF2)蛋白的表达与肝细胞癌的关系.方法:用免疫组化方法检测21例正常肝组织,58例肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)及其对应癌旁组织(n=58)中GCF2的表达情况.结果:GCF2在HCC组织中的阳性表达率(31.0%,18/58)显著低于癌旁(84.5%,49/58)和正常肝组织(90.5%,19/21)(P<0.05),GCF2在HCC组织中的表达量亦显著低于癌旁和正常肝组织(P<0.05);GCF2的阳性表达与HCC患者的性别、年龄、肿瘤大小、临床分期、有无肝硬化基础、AFP及HBsAg情况之间的差异无统计学意义(P>0.05).结论:GCF2在HCC中的表达下降与HCC的发生可能有一定关系.
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GCF2基因片段原核表达载体的构建与鉴定
目的 构建肝癌相关抗原GCF2基因片断(323～1 234 bp)原核表达重组质粒.方法 提取人肝癌组织总RNA,通过反转录酶合成cDNA;根据GenBank公布的GCF2基因cDNA序列设计引物,利用RT-PCR法扩增出人GCF2基因片断(编号2-5a),将此片段连接在克隆载体pGEM-T上进行测序,通过酶切、连接将目的 片断重组到原核表达载体pET-30a上.结果 酶切电泳鉴定结果显示GCF2基因同源片段克隆入载体中,测序结果证实克隆的基因序列与GenBank中GCF2基因相应序列完全相符.结论 获得了含人GCF2基因同源片段重组原核表达质粒pET-30a/GCF2-5a,为进一步表达和纯化GCF2基因片段重组蛋白奠定了基础.
