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外周血循环肿瘤细胞及人表皮生长因子受体2胞外区表达在进展期胃癌治疗疗效评估中的价值
目的 研究人血清中表皮生长因子受体2胞外区(HER2 ECD)与外周血循环肿瘤细胞(CTC)的相关性,并进一步研究组织学HER2阴性或阳性胃癌患者中,HER2 ECD动态变化及与治疗疗效的关系.方法 将北京大学肿瘤医院消化肿瘤内科2012年1月至2014年1月期间收治、并曾入组中国进展期胃癌CTC临床研究(ClinicalTrial gov. ID: NCT01625702)的53例患者入组本回顾性研究.入组条件:除病理组织学确诊为进展期胃癌外,至少接受2个周期以氟尿嘧啶为基础的化疗或联合靶向治疗,并同时进行了治疗前后外周血CTC的计数;按实体瘤的疗效评价标准(RECIST),治疗前至少具有一个可测量的靶病灶;患者需经医院伦理委员会同意及患者知情同意.留取患者治疗前及治疗2周期后的血清,利用化学发光免疫分析法进行血清样本中HER2 ECD水平的检测.HER2 ECD阳性阈值为≥15 ng/ml; CTC计数阳性阈值为≥3个/7.5 ml.采用Log-rank检验不同组间无进展生存期(PFS)及总体生存期(OS)的差异.结果53例进展期胃癌患者HER2阴性39例,HER2阳性的9例(17.0%),另5例检测状态未知.均接受氟尿嘧啶为基础的化疗,9例HER2阳性患者在化疗基础上联合抗HER2靶向治疗.治疗前全组血清HER2 ECD中位浓度为10.45(8.0~83.2)ng/ml;HER2 ECD阳性7例(13.2%),其中4例为HER2阳性患者外,3例HER2阴性患者同样存在血清HER2 ECD阳性;CTC中位数为2(0~668)个/7.5 ml,CTC阳性25例(47.2%).HER2阴性患者中有10例治疗后血清HER2 ECD阳性,其中有2例患者在治疗前其HER2 ECD分别为83.3 ng/ml和46.9 ng/ml,治疗后则为22.4 ng/ml和20.4 ng/ml;另8例治疗前HER2 ECD均<15 ng/ml(10.3~14.5 ng/ml),但在治疗2个周期后发生获得性HER2 ECD水平升高(15.1~19.5 ng/ml).治疗后血清HER2 ECD水平升高患者外周血CTC水平通常较低,但相关性未达统计学差异.HER2阴性病例,治疗前血清HER2 ECD阳性患者与HER2 ECD阴性患者的PFS (7.6月比4.4月,P=0.328)及OS(13.6比10.9,P=0.679)比较,差异无统计学意义.HER2阳性病例,治疗前 HER2 ECD 阳性者其 PFS(10.7月)和 OS(16.5月)均显著长于 HER2 ECD 阴性者(4.2月和8.9月),差异有统计学意义(P=0.025, P=0.015).HER2阴性病例,治疗前CTC计数阴性者PFS和OS(5.3月和14.3月)显著长于CTC计数阳性患者(3.3月和7.6月),差异有统计学意义(P=0.049,P=0.001).而HER2阳性者,CTC计数多少均与PFS及OS无关(均P > 0.05).HER2阴性的8例治疗2周期后发生获得性HER2 ECD水平升高者,其HER2 ECD水平升高与PFS及OS无关(P > 0.05).9例HER2阳性患者,4例治疗后HER2 ECD水平下降、CTC计数下降或不变者,其PFS(7.5 ~ 15.3月)和OS(11.0 ~ 26.3月),长于治疗后HER2 ECD水平上升的2例患者,其PFS分别为3.0和4.8月,OS则分别为7.3和8.6月.结论 HER2阳性胃癌患者治疗前HER2 ECD水平升高预示更好的PFS及OS,且治疗过程中HER2 ECD获得性升高预示疗效不佳.HER2 ECD水平可在HER2阴性患者中获得性升高,且与外周血CTC计数水平变化存在相关性.
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eglA P-Her2/neu-IL-12融合基因穿梭载体的构建
目的:构建重组厌氧芽胞梭菌saccharobutylicum内源性β-1,4葡聚糖酶启动子(edA p)-人表皮生长因子受体2胞外区(hHer2/neu ECD)-人白细胞介素12(rhIL-12)融合基因穿梭表达载体(pIMP1 eglA p-hHer2/neu ECD-rhIL-12),为进一步制备eglAp-hHer2/neu-rhIL-12融合基因修饰的厌氧芽胞梭菌,并探讨其对Her2/neu+实体肿瘤的基因治疗作用奠定基础.方法:以含有全长hHer2/neu序列的真核表达质粒(pcDNA3.1 hHer/neu)为模板,采用PCR方法,扩增hHer2/neu ECD基因片段;将其插入重组rhIL-12真核表达质粒pcD-NA6 rhIL-12(p1)中的rhIL-12基因上游,获得pcDNA6 hHer2/neu ECD-rhIL-12(p2)真核表达质粒;设计合成eglAp基因中一段55 bp序列作为模板,通过连续PCR的方法,扩增eglAp片段(335 bp),并构建T-eglA p(p3)亚克隆质粒;通过酶切连接的方法,将eglA p片段插入p2质粒中的hHer2/neu ECD基因上游,构建pcDNA6 eglA p-hHer2/neu ECD-rhIL-12(p4)真核表达质粒;通过in-fusion技术,将融合基因eglAp-hHer2/neu ECD-rhIL-12插入pIMP1穿梭表达质粒,构建重组pIMP1eglA p-hHer2/neu ECD-rhIL-12(p5)穿梭表达载体,并进行菌液PCR、酶切及测序鉴定.结果:获得的hHer2/neu ECD和eglA P片段及p2、p3、p4重组质粒、p5融合基因重组穿梭表达载体,其PCR产物和酶切片段大小与预期一致,测序结果证实各基因序列与GenBank中mRNA或DNA序列一致.结论:成功地构建了大肠杆菌-厌氧芽胞梭菌融合基因穿梭表达载体(pIMP1 eglAp-hHer2/neu ECD-rhIL-12),为进一步制备eglAp-hHer2/neu ECD-rhIL-12融合基因修饰的厌氧芽胞梭菌,探讨其对Her2/neu+实体肿瘤的基因治疗作用奠定基础.
关键词： eglA启动子 人表皮生长因子受体2胞外区 IL-12 穿梭表达质粒
