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改良分子信标-实时PCR快速检测4种食源性致病菌
目的 建立高效、特异、简便、快速的四重实时荧光PCR(real-time PCR)检测体系同时检测沙门菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、大肠杆菌O157:H74种常见的主要食源性致病菌. 方法 从GenBank数据库中下载沙门菌侵袭性基因ssaR、金黄色葡萄球菌肠毒素nuc基因、单增李斯特菌的hlyA基因、大肠杆菌O157∶H7的rfbE基因序列,设计引物和探针,利用HAND系统和多色探针编码技术,通过对PCR反应的组分和条件进行优化,建立针对肉类食品中4种食源性致病菌四重实时荧光PCR体系. 结果 成功建立了检测肉类食品中4种食源性致病菌四重实时荧光体系,DNA和细菌纯培养的低检测限达到1～100 fg/PCR和1～ 6.25 CFU/PCR,特异性均达98％以上. 结论 本文利用HAND系统和多色探针编码技术相结合,构建了针对4种食源性致病菌四重实时荧光PCR体系.可用于食品中食源性致病菌的快速筛查和食源性疾病暴发的快速诊断.
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基于同源加尾系统的改良分子信标荧光PCR检测香港海鸥形菌方法的建立
目的 针对香港海鸥形菌,利用同源加尾系统(Homo Tag Assisted Non-Dimer,简称HAND)建立一种基于改良分子信标的荧光PCR检测方法,并对这种方法进行条件优化和评价. 方法 根据香港海鸥形菌的基因保守序列16S-rDNA基因设计探针和特异性引物,并在引物的5'端加上同源尾巴序列,减少或避免引物二聚体的形成,通过优化通用尾巴引物和特异性加尾引物的浓度与反应温度等PCR参数构建荧光PCR的反应体系. 结果 建立的基于HAND系统的改良分子信标PCR的检测体系引物二聚体明显减少,检出限达到20 CFU/ml. 结论 建立的基于HAND系统的改良分子信标荧光PCR检测方法具有检测时间短、灵敏度高、特异性好的优点,能够应用于香港海鸥形菌的快速筛查.
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基于同源加尾系统的4种腹泻病毒的多重RT-PCR检测方法
目的 针对轮状病毒、诺如病毒、星状病毒和扎如病毒四种常见腹泻病毒,建立基于同源加尾(Homo-Tag Assisted Non-Dimer,HAND)系统的一步法四重RT-PCR检测方法.方法 根据4种病毒基因组保守序列设计引物并在5'端加上同源尾巴序列.通过优化通用尾巴引物和特异性加尾引物的浓度等PCR参数构建四重RT-PCR反应体系,并系统评价其稳定性、特异性和灵敏度.结果 成功建立基于HAND系统的4种腹泻病毒一步法多重RT-PCR检测方法.特异性分析显示四种病毒间无交叉反应,灵敏度分析显示轮状病毒、诺如病毒、星状病毒和扎如病毒的检测下限分别达到48、9.6、1.92和48 pg.结论 所建立的基于HAND系统的4种腹泻病毒多重RT-PCR检测方法简便快速、灵敏特异稳定、成本低廉,非常适用于基层医学实验室.
