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靶向克隆法构建NY-ESO-1基因的原核表达载体
目的:利用PCR产物靶向克隆法构建人癌-睾丸抗原NY-ESO-1的原核表达载体.方法:从人新鲜的食管癌组织中提取总RNA,通过RT-PCR技术扩增NY-ESO-1基因3'端的340 bp片段,采用靶向克隆法将目的基因插入到原核表达载体pET-15b中,得到重组表达质粒pET-15b-NY-ESO-1,经过筛选,挑选出阳性克隆进行Xho Ⅰ和BamHⅠ双酶切图谱分析、PCR检测和扩增产物核苷酸序列分析等,鉴定所构建的原核表达载体.结果:扩增得到NY-ESO-1基因片段,经测序证实与GenBank公布的序列一致,重组的质粒经过PCR,酶切鉴定获得了一个大小为340 bp的特征性片段,证明重组质粒中已成功的插入了目的基因NY-ESO-1.结论:靶向克隆法可快速、高效地构建人NY-ESO-1基因的原核表达载体,为制备pET-15b-NY-ESO-1融合蛋白奠定了基础.
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PCR靶向克隆法构建携带人类神经生长因子β基因的含有EGFP的重组腺病毒穿梭质粒
目的:在靶向克隆酶的作用下,利用PCR靶向克隆构建携带人神经生长因子的重组腺病毒穿梭质粒pShuttle-hNGFβ-EGFP.方法:按PCR引物设计原则设计两条引物,分别在上下游引物的5'端加上12个碱基与线性化载体切口两端同源载体序列,引物合成后PCR反应扩增目的基因hNGF-β,提纯后与EcoRV酶切的穿梭质粒pShuttle-IRES-hrEGFP在靶向克隆酶(LP Recco enzyme)的作用下37℃孵育15 min,转化感受态大肠杆菌,碱裂解法制备及纯化质粒DNA.结果:EcoRV酶切鉴定证实pShuttle-hNGFβ-EGFP构建成功.结论:在不需要限制性内切酶的情况下用靶向克隆酶连接可快速、准确得到穿梭质粒pShuttle-hNGFβ-EGFP.
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PCR产物靶向克隆法构建pET15b-CAT及His-tag-CAT融合蛋白的表达与纯化
目的:将人过氧化氢酶(Catalase,CAT) cDNA 的PCR扩增产物定向克隆到pET15b载体上以构建重组质粒pET15b-CAT,并表达和纯化出His-tag-CAT融合蛋白. 方法:扩增目的基因的PCR引物的5′端加上与线性化载体同源的碱基序列,以使PCR的扩增产物两端分别带上15个和线性化载体两端同源的碱基序列.以pZeoSV2(+)-CAT为模板进行靶向克隆所需的人CAT cDNA扩增. 将纯化的人CAT cDNA PCR产物与经XhoⅠ和BamHⅠ酶切的线性化载体pET15b以6∶1摩尔数之比混合于含重组酶的反应液中,25 ℃反应30 min,将PCR产物定向克隆于目标载体pET15b上,获得重组质粒pET15b-CAT.重组质粒经PCR,XhoⅠ酶切和DNA测序鉴定.pET15b-CAT转化BL21(DE3)宿主菌,用IPTG诱导表达出His-tag-CAT融合蛋白,采用Ni2+-NTA树脂进行亲和层析. 结果:人CAT cDNA的PCR扩增产物与经XhoⅠ和BamHⅠ酶切的线性化载体pET15b发生了同源重组反应,经鉴定采用PCR产物靶向克隆法成功构建了pET15b-CAT.SDS-PAGE和Western blot结果表明,转化了pET15b-CAT的宿主菌表达出了His-tag-CAT融和蛋白,经Ni2+-NTA树脂亲和层析得到了纯化的His-tag-CAT,并在体外检测到其具有特异的过氧化氢酶的活性,活性值为80.23 U/g.结论:采用PCR产物靶向克隆法成功地构建了pET15b-CAT,并表达和纯化出了His-tag-CAT融和蛋白,为采用外源性CAT防治与氧化应激损伤相关性疾病奠定了基础.
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PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒
目的:将PCR 扩增产物人内皮型一氧化氮合酶(heNOS)cDNA定向克隆到载体pShuttle-IRES-hrGFP-2以构建重组质粒pShuttle-heNOS-EGFP. 方法:在扩增目的基因的PCR引物5′端加上与线性化载体同源的15个碱基, 使PCR反应产物两端分别带上15个和线性化载体两端同源的碱基序列.EcoR Ⅰ酶切质粒pHCMVsp1A-heNOS,回收heNOS cDNA作为模板,进行PCR扩增.将纯化的PCR产物heNOS cDNA与EcoR V酶切后的线性化载体pShuttle-IRES-hrGFP-2以摩尔数为8∶1 比例混和,在重组酶作用下,25 ℃反应30 min,将PCR产物定向克隆入目标载体pShuttle-IRES-hrGFP-2上,获得阳性重组质粒pShuttle-heNOS-EGFP.重组质粒经PCR、酶切和测序鉴定. 结果:经鉴定, 成功构建出重组质粒pShuttle-heNOS-EGFP. 结论:无需传统的酶切、连接、载体去磷酸化等手段, 利用PCR产物靶向克隆法,可快速、高效完成PCR 产物的定向克隆.
关键词： 多聚酶链式反应 靶向克隆 人内皮型一氧化氮合酶 -
靶向克隆法构建pET15b-VP3原核表达载体
目的 探索利用PCR产物靶向克隆法构建能够表达凋亡素的pET15b-VP3原核表达载体.方法 以PGEX-6P-1/TAT-VP3质粒为模板,PCR扩增VP3基因的366 bp片段,应用靶向克隆酶,将VP3基因插入到线性pET15b,得到重组表达载体pET15b-VP3,经过筛选,挑选出阳性克隆进行Xho Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切,图谱分析和重组质粒核苷酸序列分析以鉴定所构建的原核表达载体.结果 PCR产物经过电泳鉴定可见366 bp特征性的VP3片段,重组质粒经双酶切电泳获得了一个大小为366 bp的VP3片段,重组质粒测序证实VP3 cDNA编码区成功地插入了pET15b,且其序列与GeneBank中VP3 cDNA序列完全一致.结论 靶向克隆法可快速,高效地构建pET15b-VP3原核表达载体,为进一步研究VP3药用价值奠定了基础.
关键词： pET15b-VP3 靶向克隆 原核表达
