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p38 MAPK在MRP8/14诱导小鼠胚胎成纤维细胞凋亡中的作用
目的 探讨p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)对髓样相关蛋白8(MRP8)/髓样相关蛋白14(MRP14)诱导小鼠胚胎成纤维细胞凋亡的影响.方法 制备MRP8、MRP14、MRP8/14备用.分别取p38+/+和p38-/-细胞,随机分为空白对照组、MRP8组、MRP14组、MRP8/14组.MRP8组、MRP14组、MRP8/14组分别加入50 μg/mL MRP8、MRP14和MRP8/14.空白对照组加入等体积的DMEM培养液.各组干预24、48 h,采用MTT法检测p38+/+和p38-/-细胞活力.采用流式细胞术检测空白对照组及MRP8/14干预24、48 h组p38+/+和p38-/-细胞凋亡率.采用MTT法检测空白对照组、MRP8/14组以及TLR4受体抑制剂TAK242或RAGE中和抗体处理的MRP8/14(分别设为MRP8/14+TAK242组、MRP8/14+RAGE组)干预24 h p38+/+细胞活力.采用MTT法和流式细胞术检测空白对照组、MRP8/14组以及p38激酶抑制剂SB203580处理的MRP8/14(设为MRP8/14+SB203580组)干预24 h p38+/+细胞活力和凋亡率.采用Western blotting法检测MRP8/14干预0、1、2、4、6、8 h p38+/+细胞p38 MAPK磷酸化.结果 MRP8组、MRP14组、MRP8/14组干预24、48 h p38+/+、p38-/-细胞活力均低于空白对照组(P均<0.05),但无论MRP8/14组干预24 h还是48 h,p38-/-细胞活力明显高于p38+/+细胞(P均<0.05).MRP8/14干预24、48 h组p38+/+细胞凋亡率均高于空白对照组,且MRP8/14干预48 h组细胞凋亡率更高(P均<0.05);而MRP8/14干预24、48 h组p38-/-细胞凋亡率均未见明显变化(P均>0.05).MRP8/14组、MRP8/14+RAGE组干预24 h p38+/+细胞活力低于空白对照组、MRP8/14+TAK242组干预24 h(P均<0.05).MRP8/14+SB203580组干预24 h p38+/+细胞活力较MRP8/14组干预24 h明显升高,细胞凋亡率较MRP8/14组干预24 h明显降低(P均<0.05).MRP8/14干预2、4、6 h p38+/+细胞p38 MAPK磷酸化水平明显高于干预0、1、8 h(P均<0.05).结论 p38 MAPK能促进MRP8/14诱导的小鼠成纤维细胞凋亡,其机制可能与TLR4-p38 MAPK信号通路激活有关.
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髓样相关蛋白8真核表达载体的构建及其细胞内定位
目的:构建小鼠髓样相关蛋白8(MRP8)的真核表达栽体,观察其在NIH3T3细胞中的表达定位情况.方法:提取BALB/c小鼠肝脏组织的总RNA,通过逆转录-聚合酶链反应扩增得到MRP8编码序列,并将其克隆到带有血凝素(HA)标记的载体pcDNA3-HA上,随后将重组质粒瞬时转染NIH3T3细胞,利用荧光显微镜观察结果.结果:重组质粒经聚合酶链反应、酶切和测序鉴定证明构建正确,并且该质粒能够在NIH3T3细胞的胞浆、胞核中广泛表达,表达产物主要定位在细胞核中.结论:成功构建带有HA标签的MRP8真核表达载体.该载体能在哺乳动物细胞中有效表达并正确定位,为进一步研究MRP8作用细胞的信号通路提供了一个重要的工具.
