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人软骨肉瘤中miR-140-5p靶基因预测验证及对靶基因表达的调控作用观察
目的 预测并验证人软骨肉瘤中miR-140-5p的靶基因,观察人软骨肉瘤中miR-140-5p对靶基因的调控作用.方法 ①miR-140-5p在人软骨肉瘤中的靶基因预测及验证:采用microRNA.org软件检索miR-140-5p序列,miRBase、miRWalk靶基因预测分析数据库预测miR-140-5p在人软骨肉瘤中的靶基因,认为miR-140-5p在人软骨肉瘤中的靶基因可能为葡萄糖转运蛋白1(GLUT-1).通过NCBI GenBank检索GLUT-13′UTR序列.构建野生型(WT,正常表达)、突变型(MUT,抑制表达)GLUT-13′UTR双荧光素酶报告载体.取人胚肾细胞HEK 293T分为A、B组,分别转染miR-140-5p mimics(促进miR-140-5p表达)+WT型GLUT-13′UTR荧光素报告载体、miR-140-5p mimics+MUT型GLUT-13′UTR荧光素报告载体,利用荧光素酶活性检测试剂盒测算萤火虫荧光素酶相对活性.②转染miR-140-5p对人软骨肉瘤细胞株JJ012的GLUT-1 mRNA及蛋白表达影响:取对数生长期JJ012细胞分为观察组、对照组,分别转染miR-140-5p mimics、NC mimics(空白无意义),转染24 h时采用qRT-PCR法检测两组细胞GLUT-1 mRNA,采用Western blotting法检测两组细胞GLUT-1蛋白.结果 ①miR-140-5p在人软骨肉瘤中的直接靶基因可能为GLUT-1.A、B组荧光素酶活性分别为0.37±0.03、0.93±0.01,二者比较,P<0.05.②观察组、对照组细胞GLUT-1 mRNA相对表达量分别为0.31±0.10、0.95±0.06,二者比较,P<0.05.观察组、对照组细胞GLUT-1蛋白相对表达量分别为0.42±0.13、0.93±0.07,二者比较,P<0.05.结论 miR-140-5p在人软骨肉瘤中的靶基因可能为GLUT-1.miR-140-5p主要通过靶向结合GLUT-13′UTR区域进行mRNA转录后调控.miR-140-5p主要通过直接靶向作用于GLUT-13′UTR进而抑制蛋白翻译过程.
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miR-140-5p对脂多糖介导牙髓干细胞增殖及分化的作用
目的 探讨miR-140-5p在脂多糖(LPS)介导的牙髓干细胞(DPSC)增殖和分化过程中的作用.方法 从成人第三磨牙的牙髓中分离提取DPSC,用浓度为1μg/mL的LPS刺激DPSC,分别于第0、1、3、5、7天检测DPSC内miR-140-5p的表达;用不同浓度(0.01、0.1、1、10μg/mL)LPS刺激DPSC 5 d,用qPCR技术检测DPSC内miR-140-5p的表达.将培养好的DPSC随机分为对照组、miR-140-5p组、抑制剂组,用对照miRNA、miR-140-5p模拟物和抑制剂分别转染各组细胞,并用1μg/mL的LPS进行干预.用MTT法检测DPSC的增殖能力,用碱性磷酸酶染色和茜素红S染色法检测DPSC分化能力.结果 随LPS干预时间延长、浓度升高,DPSC内miR-140-5p的相对表达量逐渐降低(P均<0.05).转染及LPS干预第5、7天,miR-140-5p组增殖能力较对照组、抑制剂组高(P均<0.05),抑制剂组增殖能力较对照组低(P均<0.05);转染及LPS干预24 h,miR-140-5p组分化能力较对照组、抑制剂组低(P均<0.05).结论 miR-140-5p过表达可促进LPS介导的DPSC增殖,并抑制其向成牙本质细胞分化.
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微小RNA-140-5p抑制胶质瘤细胞株U251、U87增殖和侵袭性的研究
目的 分析微小RNA(miRNA,miR)-140-5p在人脑胶质瘤组织中的表达水平,观察miR-140-5p对胶质瘤细胞株增殖、凋亡与侵袭的影响.方法 通过实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测人脑胶质瘤组织与U251、U87MG细胞株中miR-140-5p的表达;用脂质体将miR-140-5pmimics转染至U251与U87MG细胞,同时设立空白及阴性对照组,Real-time PCR检测转染前后miR-140-5p在细胞中的表达水平.应用荧光显微镜观察转染效率,细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测细胞增殖能力,流式细胞仪分析细胞周期与凋亡;Transwell实验判断U251、U87MG的侵袭能力.结果 miR-140-5p在人脑胶质瘤组织及胶质瘤细胞株中表达明显低于非瘤脑组织,并且随着肿瘤恶性程度不断增加,miR-140-5p表达逐渐降低(非瘤脑组织、低级别与高级别胶质瘤相对表达量分别为1.013、0.375和0.130,P＜0.01).U251和U87MG细胞转染miR-140-5p mimics后细胞的增殖与侵袭能力明显受到抑制,其中相对增殖率分别为61.22％与58.44％,穿膜细胞数亦减少了约50％,细胞周期阻滞于G0/G1期(P＜0.01).转染miR-140-5p mimics后胶质瘤细胞株的凋亡率明显升高＞12％(P＜0.01).结论 miR-140-5p在胶质瘤组织中低表达,过表达miR-140-5p可以抑制胶质瘤细胞株U251和U87MG的增殖,阻滞细胞周期,促进其细胞凋亡,并可有效抑制其侵袭力.
关键词： 微小RNA-140-5p 胶质瘤 细胞增殖 凋亡 侵袭
