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人胃黏膜细胞cDNA文库和pGBKT7-p37重组质粒的构建
目的构建人胃黏膜细胞cDNA文库,并选取VacA毒素的p37片段将其克隆到pGBKT7以表达BD-p37融合蛋白作为诱饵.为进一步用所此诱饵来筛选所构建文库以其找到与VacA相互作用的蛋白奠定基础.方法用TRIzol试剂从胃腺癌病人手术切除的正常胃黏膜细胞中抽取总RNA经LD-PCR得到双链cDNA,参照Clontech 的MATCHMAKER Library Construction and Screening Kit 构建cDNA文库并用文库所含的独立克隆数和含插入片段的克隆数占总克隆数的比例来评价酵母双杂交文库的质量.用PCR从Helicobacter pylor基因组中扩增出p-37基因将其克隆入pGBKT7载体并使插入片段与GAL4 BD同框,插入片段的大小和序列的正确性由双酶切和测序得以证实.结果文库中共有1.9×106个独立克隆,含插入片段克隆所占比例为91.7%.双酶切和测序结果表明p37的正确插入,Western blot 结果证明了融合蛋白的表达.结论构建了较高质量的cDNA文库和与GAL4 BD融合的诱饵蛋白,为进一步的研究奠定了基础.
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甜菜碱提高长距离PCR扩增效率的研究
目的:利用甜菜碱优化长距离PCR(LD-PCR),提高血友病A(HA)基因倒位检测效率.方法:在LDPCR反应体系中加入DMSO、甘油及不同浓度的甜菜碱进行LD-PCR扩增,比较扩增结果.用甜菜碱优化LD-PCR检测正常人、不同程度HA患者及携带者的FⅧ基因是否存在FVE基因22号内含子(IVS22)倒位.结果:在反应体系中加入甜菜碱可获得更好的LD-PCR扩增结果:甜菜碱优化LD-PCR的佳终浓度为0.8～1.8 mol/L;应用甜菜碱优化LD-PCR检出3例HA患者、2例携带者和1例可疑携带者FⅧ基因有IVS22倒位.结论:一定浓度的甜菜碱可以显著提高LD-PCR的扩增效率,提高检测出HA患者的FⅧ基因IVS22倒位的效率.
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LD-PCR检测FⅧ基因XbaⅠ位点多态性及其在血友病A携带者诊断中的应用
目的 建立高特异性的针对凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因内含子22中Xba Ⅰ多态性位点的连锁分析法,以用于血友病A家系携带者的诊断.方法 采用长距离PCR(LD-PCR)方法,特异性地扩增FⅧ基因内含子22中的XbaⅠ位点所在区域,用限制性内切酶XbaⅠ酶切,对5个血友病A家系作家系连锁分析,并对其中可提供多态性信息的家系作携带者诊断.结果 家系1中确诊女性携带者1名及1名正常女性成员；家系2中确诊1名女性携带者；而家系3、家系4和家系5该位点无法提供多态性信息.结论 基于LD-PCR的FⅧ基因Xba Ⅰ位点连锁分析方法具有较高的准确性和可靠性,这对临床上诊断血友病A携带者具有积极的意义.
