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抗MTB FurB单克隆抗体制备及特性分析
目的 制备针对结核分支杆菌FurB蛋白的单克隆抗体(mAb)并分析其特性.方法 利用纯化的FurB蛋白,采用腹股沟皮下包埋硝酸纤维素膜和腹腔内注射FurB的方法免疫小鼠,然后进行细胞融合、克隆化制备抗FurB mAb,用Western-blot鉴定其特异性,用ELISA法初步分析其特异性位点和相对亲和力.结果 获得3株抗FurB mAb,分别为DD12、BH1和DH8,经Western-blot分析都可与FurB蛋白特异性结合.三株mAb中DH8效价高达到10-10,相对亲和力,BH1＞DH8＞DD12,3株mAb的抗原表位相近.结论 获得的抗FurB mAb效价高、特异性强,可以作为进一步研究FurB功能和作用的有效工具.
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结核分枝杆菌FurB基因真核表达质粒的构建及表达
目的构建结核分枝杆菌铁调控基因furB真核表达载体.方法以BamHⅠ和HindIII双酶切pQE-80L-furB获得furB基因,克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-),重组质粒酶切鉴定后以阳离子聚合物转染COS-7细胞, 分别以RT-PCR方法检测mRNA表达和间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达.结果构建了重组质粒pcDNA3.1(-)-furB,RT-PCR结果证明furB可在COS-7细胞中转录,用间接免疫荧光检测,显示COS-7细胞内有FurB蛋白的表达.结论成功构建了结核分枝杆菌furB基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-furB, furB基因可以在COS-7细胞中表达.
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结核分枝杆菌furB基因的克隆、表达和纯化
目的: 从H37Rv基因组中扩增furB并高效表达和纯化. 方法: 用PCR技术从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增furB序列,将其与pGEM-T-Easy载体连接转化E.coli DH5α,构建重组克隆载体pGEM-T-Easy/furB,测序正确后将目的基因片断克隆入pQE-80L原核表达载体并转化E.coli DH5α,IPTG诱导目的蛋白表达. 经Western blot鉴定目的基因与(His)6融合表达,将已表达的蛋白质通过Ni2+-NTA亲和色谱柱进行纯化. 结果: PCR得到结核分枝杆菌furB,测序结果与Genbank中报道的完全一致. SDS-PAGE显示,在Mr为15.0×103处有相应的蛋白质表达条带,Western blot鉴定为(His)6融合表达蛋白. 经Ni2+-NTA亲和色谱柱进行纯化后可得到纯化的蛋白. 结论: 成功克隆了铁调节蛋白基因furB序列,并在E.coli DH5α高效表达,亲和层析后获得了纯化目的蛋白.
