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miR-181a促进人子宫内膜间质细胞蜕膜化催乳素的表达
目的 目前虽已发现一些在胚胎着床过程中起重要作用的分子,但微小RNA(microRNA,miRNA)在蜕膜化过程中作用的研究报道较少,文中调查孕鼠围着床期子宫组织中miR-181a的表达规律,并探讨miR-181a对人子宫内膜间质细胞(human endometrial stromal cell,hESC)体外诱导蜕膜化过程中蜕膜化标志基因蜕膜化催乳素(decidual prolactin,dPRL)表达的调控作用.方法 收集怀孕0～6.5d孕鼠子宫组织,采用TRIZOL法提取总RNA,通过实时定量PCR检测子宫组织中miR-181a的表达.制备Ad-miR-181a重组腺病毒,并感染hESC,24h后采用0.5mmol/L 8-Br-cAMP 和1μmol/L Medroxyprogesterone(MPA)联合进行体外蜕膜化诱导培养;通过化学发光免疫法和实时定量PCR分别检测细胞培养液上清中dPRL的浓度与间质细胞中催乳素(prolactin,PRL)mRNA的表达;同时采用荧光素酶报告基因检测miR-181a对hESC中dPRL(-332/+65)启动子的调控作用.结果 早孕小鼠子宫组织中 miR-181a 的表达高于非妊娠小鼠子宫,且随着妊娠天数的增加呈逐渐上升的趋势,在小鼠着床"窗口期"即孕 4.5d达到高峰(2.60±0.15倍,P＜0.01,n=5),孕 5.5d子宫miR-181a的表达开始平稳下降;成功获得滴度为5.19×1010ifu/ml的miR-181a腺病毒,该腺病毒介导的miR-181a过表达显著增加hESC蜕膜化标志基因dPRL mRNA表达水平,增高超过8倍(P＜0.01);在8-Br-cAMP和MPA联合诱导hESC体外蜕膜化时,高表达miR-181a可明显增加8-Br-cAMP联合MPA诱导的PRL mRNA表达水平与PRL蛋白分泌(P＜0.01).荧光素酶报告基因进一步证实miR-181a可以激活dPRL(-332/+65)启动子的活性达到2倍(P＜0.05).结论 miR-181a参与8-Br-cAMP和MPA诱导子宫内膜间质细胞蜕膜化过程中PRL的表达调控.
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HOXA10与连续TTAT基序结合抑制p/CAF表达
目的:转录因子HOXA10在胚胎着床和子宫内膜蜕膜化过程中发挥重要作用.p/CAF是HOXA10新的靶基因,文章旨在筛选并鉴定p/CAF启动子区与HOXA10功能性结合的序列. 方法:制备重组腺病毒HOXA10(ad-HOXA10),用于感染人子宫内膜间质细胞(hESC);构建p/CAF启动子区多种突变报告基因质粒;采用萤光素酶报告基因实验检测结合腺病毒介导的HOXA10基因过表达,分析hESC中HOXA10对p/CAF启动子转录活性的调控. 结果:获得滴度为2.4×1011ifu/mL的重组ad-HOXA10,对hESC的感染率达到80%以上.HOXA10通过结合连续的3个TTAT(-710～ -674nt)基序抑制p/CAF启动子活性,连续的3个TTAT基序的一级结构影响HOXA10的功能性结合. 结论:p/CAF启动子区连续的3个TTAT基序是HOXA10功能性结合所必须的,HOXA10可能通过调控p/CAF的表达来控制hESC的增殖与分化.
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P300/CBP相关因子(PCAF)表达水平对人子宫内膜间质细胞增殖的影响
目的:观察P300/CBP相关因子(P300/CBP associated factor,PCAF)对人子宫内膜间质细胞增殖的调控作用.方法:通过Western blotting、实时定量PCR及Cell Counting Kit-8(CCK-8)细胞增殖实验,观察分析Ad-FLAG-PCAF重组腺病毒介导的PCAF过表达及PCAF-siRNA介导的PCAF低表达对体外培养的人子宫内膜间质细胞增殖的影响.结果:获得滴度为8×1010 ifu/ml的重组Ad-FLAG-PCAF腺病毒,转染体外培养的人子宫内膜间质细胞后,可有效介导细胞内FLAG-PCAF融合蛋白的高表达；而转染PCAF特异的siRNA后,可有效抑制人子宫内膜间质细胞中PCAF的表达. PCAF过表达的人子宫内膜间质细胞中,其细胞周期标志蛋白cyclinD1和cyclinD3的表达水平显著降低(P＜0.05),而PCAF低表达的人子宫内膜间质细胞中,其cyclinD1和cyclinD3的表达水平显著升高(P＜0.05)；此外,CCK-8实验结果显示,PCAF过表达能显著抑制由雌、孕激素共同刺激所引起的人子宫内膜间质细胞的增殖,而基因沉默人子宫内膜间质细胞中内源性PCAF的表达后,间质细胞的增殖增加＞20％(P＜0.05).结论:PCAF可能通过蛋白乙酰化修饰作用,参与调控人子宫内膜间质细胞的增殖过程.
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一种高效分离原代人子宫内膜间质和上皮细胞的方法
目的 建立一种高效分离子宫内膜上皮细胞与间质细胞的方法.方法 收集全子宫切除患者的健康子宫内膜组织,将子宫内膜组织剪碎后,采用二次酶消化-二次过滤-差时贴壁的方法将人子宫内膜间质细胞(HUSC)与上皮细胞(HUEC)分离.采用流式细胞仪鉴定分离所得人子宫内膜基质和上皮细胞;并进一步对原代子宫内膜间质细胞进行诱导蜕膜化.结果 流式细胞术检测分离的间质细胞波形蛋白阳性率为(97.0±2.5)％,上皮细胞角蛋白阳性率为(90.0±4.1)％.此外,使用环磷酸腺苷(cAMP)联合醋酸甲羟孕酮(MPA)体外诱导子宫内膜间质细胞产生了良好的蜕膜化反应.结论 成功建立了一种高效分离原代人子宫内膜基质和上皮细胞的方法.
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MST1重组腺病毒的制备及对人子宫内膜间质细胞蜕膜化的作用
目的:探讨丝/苏氨酸激酶MST1在人子宫内膜间质细胞蜕膜化过程中的作用.方法:制备Ad-FLAG-MST1重组腺病毒,用于感染人子宫内膜间质细胞;采用荧光定量PCR实验结合腺病毒介导的MST1基因过表达,分析人子宫内膜间质细胞蜕膜化进程中MST1的表达及其对蜕膜化特异性基因的调控.结果:获得滴度为2×10~(11)ifu/ml的重组Ad-FLAG-MST1腺病毒,该腺病毒感染人子宫内膜间质细胞后,可高水平表达FLAG-MST1融合蛋白,过表达的MST1显著增加人子宫内膜间质细胞中PRL、IGFBP1、TIMP3和DCN等蜕膜化特异性基因的表达;体外培养的人子宫内膜间质细胞经8-Br-cAMP(0.5 mmol/L)和MPA(1μmol/L)刺激后,细胞中MST1总蛋白水平增加3倍以上,同时磷酸化的MST1(Thr183)显著增加.结论:MST1的活化可能参与子宫内膜间质细胞的蜕膜化相关基因的调控.
