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miR?590靶向SIP1抑制胆管癌细胞上皮间充质转化的实验研究
目的 探讨miR?590在胆管癌细胞上皮间充质转化( EMT)中的作用及可能机制.方法 采用荧光定量PCR(QPCR)检测人正常肝内胆管上皮细胞系HIBEC以及人胆管癌细胞系HUCCT1、HCCC?9810、RBE中miR?590的表达情况.双荧光素酶报告试验评价miR?590对SIP1的靶向调控作用.向HUCCT1细胞转染miR?590 mimics(转染组)和无义核苷酸序列(NC组),Western blotting检测两组EMT相关蛋白的表达.向HUCCT1细胞转染SIP1 siRNA,Western blotting检测干扰SIP1后EMT相关蛋白的表达.结果 HUCCT1、HCCC?9810、RBE细胞系中miR?590水平分别为0. 37±0. 084、0. 31±0. 071和0. 53±0. 089,显著低于人正常肝内胆管上皮细胞系HIBEC的1. 12±0. 201,差异具有统计学意义(P＜0. 05). miR?590可抑制野生型SIP1 3’UTR报告基因载体的荧光素酶活性,而对突变型SIP1 3’UTR?MUT的荧光素酶活性无影响.转染miR?590 mimics可以下调HUCCT1细胞中Vimentin、N?cadherin、ZEB1、ETS1、SNAIL1及TWIST1蛋白表达,上调E?cadherin蛋白表达.SIP1沉默能上调上皮标志物E?cadherin蛋白表达,并下调间充质蛋白Vimentin和N?cadherin蛋白表达.结论 miR?590通过靶向SIP13’?UTR阻断其翻译,终抑制胆管癌细胞上皮间充质转化.
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SIP1在人舌癌Tca8113细胞中的定位和融合蛋白表达鉴定的研究
目的 检测Smad相互作用蛋白1(SIP1)在人舌癌Tca8113细胞系中的定位及融合蛋白的表达鉴定.方法 PCR扩增SIP1编码序列的全长,克隆到pCMV-Flag-MAT-Tag 1载体.利用共聚焦激光扫描显微镜观察SIP1和SIP1-Flag在人舌癌Tca8113细胞系中定位,并将构建好的Flag标签SIP1(SIP1 -Flag)真核表达载体转染到人舌癌Tca8113细胞系中,提取蛋白进行Western blot检测,利用Flag标签抗体进行免疫沉淀纯化SIP1-Flag融合蛋白.结果 构建了SIP1-Flag真核表达载体.SIP1和SIP1-Flag融合蛋白主要定位于人舌癌Tca8113的细胞核中,Western blot检测到SIP1-Flag融合蛋白表达,且在人舌癌Tca8113细胞中成功纯化SIP1-Flag蛋白.结论 成功构建真核表达载体.SIP1和SIP1-Flag主要定位于细胞核,成功鉴定融合蛋白表达并纯化SIP1-Flag融合蛋白.
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HIF-1α、SIP1及MMP-9在甲状腺乳头状癌组织中的表达及意义
目的 探讨低氧诱导因子-1 (HIF-1α) 、Smad蛋白的相互作用蛋白1(SIP1)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)在甲状腺乳头状癌(PTC)中的表达及意义.方法 采用免疫组化SP法检测72例人甲状腺乳头状癌和37例癌旁正常组织中HIF-1α、SIP1和MMP-9的表达水平,分析其表达与临床病理指标的关系及三者问表达的相关性.结果 在PTC组织中,HIF-1α、SIP1和MMP-9的阳性表达率分别为51.56％ 、51.39％和54.16％,显著高于癌旁正常组织(P＜0.01).H1F-1α、SIP1和MMP-9的表达与患者颈部淋巴结转移显著相关(P＜0.05).HIF-1α与 SIP1、HIF-1α与MMP-9、SIP1和MMP-9的表达均呈显著正相关(rs=0.304,P=0.009;rs=0.243,P=0.040;r=0.277,P=0.019).2种蛋白(HIF-1α/SIP1,HIF-1α/MMP-9,S1P1/MMP-9)联合表达较二者之一表达与颈部淋巴结转移更具相关性(P＜0.05).HIF-1α 、SIP1和MMP-9 3种蛋白联合表达较三者之一表达与颈部淋巴结转移更具有相关性(P＜0.05).结论 HIF-1α、SIP1和MMP-9在PTC组织中的表达与颈部淋巴结转移密切相关,且三者存在相互协同作用,其表达情况可能作为监测PTC颈部淋巴结转移的指标.
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Cuprizone诱导髓鞘损伤再生模型中Sip1的表达变化及其意义
目的:研究Smad相互作用蛋白1(Sip1)在cuprizone诱导髓鞘损伤再生模型中的表达变化及其意义.方法:通过在饲料中掺入cuprizone喂食C57BL/6小鼠建立髓鞘损伤模型,利用黑金(black gold,BG)染色方法及Western Blot方法,检测髓鞘损伤模型是否建立成功;利用Western Blot方法检测在髓鞘损伤及再生过程中Sip1的表达情况.结果:BG染色方法检测到喂药6周后模型组小鼠与对照组相比,着色显著降低,Western Blot方法检测到模型组小鼠MOG(myelin oligodendrocyte glycoprotein)蛋白表达水平显著降低,GFAP(glial fibrillary acidic protein)蛋白表达水平显著增高,证明髓鞘损伤模型建立成功.在模型建立成功后,停止喂药,改用正常饲料喂养4周后,通过Western Blot检测到模型组小鼠MOG蛋白水平显著恢复,证明该阶段髓鞘已再生.利用Western Blot 方法检测髓鞘损伤模型建立阶段及髓鞘再生阶段的Sip1蛋白水平,结果显示与对照组小鼠相比,在髓鞘损伤阶段,模型组小鼠的Sip1蛋白水平显著增加,在髓鞘再生阶段Sip1蛋白水平同样显著增加.结论:Sip1在髓鞘损伤再生过程中具有重要作用,本研究为Sip1作为治疗髓鞘相关疾病的靶点提供了理论依据.
