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人PRKAG2(R302Q)突变型SD乳鼠心肌细胞模型的建立及检测
目的 包装人PRKAG2(R302Q)突变型的腺病毒后感染原代SD乳鼠心肌细胞,构建细胞模型.方法 首先通过BP及LR重组获得人PRKAG2(R302Q)突变型的腺病毒表达载体,将其线性化转染293细胞进行腺病毒包装和扩增.收集纯化腺病毒液感染原代SD乳鼠心肌细胞后进行蛋白质印迹法检测.结果 PRKAG2 (R302Q)突变型的腺病毒载体经测序验证插入序列正确,腺病毒感染乳鼠心肌细胞后蛋白质印迹法检测其过表达明显(P＜0.05).结论 包装人PRKAG2(R302Q)突变型基因的腺病毒并成功感染SD乳鼠心肌细胞,为进一步研究基因PRKAG2(R302Q)突变体的功能奠定了基础.
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热休克蛋白72重组腺病毒包装及其对细胞凋亡的影响
目的 包装热休克蛋白72重组腺病毒表达载体,探讨其对ECV304细胞凋亡的影响.方法采用细菌同源重组法构建了热休克蛋白72重组腺病毒表达载体;流式细胞仪检测重组腺病毒对细胞凋亡的影响;荧光报告系统和蛋白印迹分析重组腺病毒对p53转录的调节和蛋白表达的影响.结果 成功包装了热休克蛋白72重组腺病毒,热休克蛋白72能够促进细胞凋亡,从转录水平上调p53蛋白的表达.结论 热休克蛋白72可能通过上调p53蛋白的表达促进细胞凋亡.
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包装重组腺病毒Adncam1及其体外转染神经干细胞
目的 构建腺病毒载体,将目的基因NCAM1转染入神经干细胞(NSCs).方法 制备重组质粒,完成后与大骨架质粒结合对293A细胞转染,包装成重组腺病毒载体Adncam1.对进行两次扩增,并检测滴度值.利用Adncam1转染NSCs,转染后应用QPCR、Western blot对NSCs中的NCAM1进行过表达鉴定.结果 Adncam1包装成功,两次扩增后,检测滴度值为1×1010 PFU/mL.Adncam1对NSCs转染效果明显.进行过表达鉴定,QPCR检测Adncam1转染效果为对照转染的15倍以上,Western blot检测转染效果为3倍以上.结论 重组腺病毒AdNcam1成功的将目的基因NCAM1转入NSCs.
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用于包装复制缺陷性腺病毒的低代次293细胞的培养
目的:建立体外培养低代次293细胞的方法.方法:细胞复苏,将冻存的低代次293细胞于37℃水浴中快速融解,移入75 cm2细胞培养瓶中,加入10 mL低代次293细胞培养基,6～8 h细胞贴壁后更换培养基.细胞传代,吸出培养基,用1×柠檬酸盐细胞消化液洗2遍,留取0.5 mL 37℃消化5～10 min,待细胞脱壁后加入3 mL培养基,轻轻吹匀以1:2比率传代培养.细胞冻存,以1×柠檬酸盐细胞消化液消化5～10 min,细胞脱壁后加入5 mL细胞培养基中和消化液,离心收集细胞,以1 mL的细胞冻存液(90% FBS+10% DMSO)重悬、冻存.结果:细胞传代后8h细胞完全贴壁;以腺病毒感染质粒感染293细胞14 d后可观察到腺病毒空斑形成.结论:该方法操作简便,对细胞损伤小且保持细胞生物学特性不变.
