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重组hFOXA2和hPDX1慢病毒载体诱导乳牙牙髓干细胞重编程为胰岛素生成样细胞
目的:构建重组转录因子hFOXA2和hPDX1慢病毒载体,转染乳牙牙髓干细胞,诱导其向胰岛素生成样细胞(insulin-producing cells,IPCs)分化.方法:酶消化法分离培养人牙髓干细胞(DPSCs),有限稀释法纯化培养,流式细胞术分析细胞表面标志,并进行体外多向分化诱导验证;构建重组Lenti-hFOXA2、Lenti-hPDX1慢病毒载体,Lipofectamine2000转染293T细胞进行病毒包装,通过荧光细胞计数测定病毒感染效率和滴度;以佳感染复数(MOI)感染牙髓干细胞,诱导其体外重编程为胰岛素生成样细胞,免疫荧光染色测定PDX1 、FOXA2及胰岛素原表达,ELISA法检测胰岛素分泌情况.采用SPSS13.0软件包对数据进行统计学分析.结果:体外成功分离培养人DPSCs;细胞表面表达STRO-1 (98.01％)、CDl46(98.51％)、CD34(99.54％)和CD45 (24.08％).体外成骨、成软骨、成脂肪诱导分化特异性染色阳性;成功构建重组Lenti-hFOXA2、Lenti-hPDX1慢病毒载体,双酶切和测序鉴定与GenBank的序列完全符合;病毒包装效率分别为(96.15±0.17)％和(95.49±0.21)％,感染滴度约为1.80×108 GTU/mL,佳MOI为20;诱导后的细胞表达胰岛素原、FOXA2和PDX1,胰岛素分泌量为1.92 μmol/L,较未诱导组和对照组均显著增高(P＜0.01).结论:DPSCs经重组转录因子慢病毒载体Lenti-hFOXA2、Lenti-hPDX1转染诱导,可启动细胞重编程机制,形成胰岛素生成样细胞,可作为糖尿病基因治疗的种子细胞.
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Sox2、Klf4、Oct4、c-Myc基因重编程人皮肤成纤维细胞的实验研究
目的 探讨利用Sox2、Klf4、Oct4、c-Myc基因能否将人皮肤成纤维细胞(HSF)编程为诱导性多潜能干细胞(iPS).方法 ①利用组织块贴壁法原代分离培养HSF细胞.②包装生产携带Sox2、Klf4、Oct4、c-Myc基因的逆转录病毒上清液感染HSF细胞.③病毒感染后HSF细胞培养,镜下观察HSF细胞形态学变化.④应用细胞碱性磷酸酶(AP)染色检测细胞基因表达量和体内分化畸胎瘤实验对细胞生物学特性进行鉴定.结果 原代HSF细胞编程后形态类似于胚胎干细胞,细胞AP染色阳性,内源多能基因Oct4、Sox2、Nanog、Rex1表达量增高,细胞体内可分化为畸胎瘤.结论 利用Sox2、Klf4、Oct4、c-Myc基因可将HSF细胞编程为iPS细胞.
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利用SOX2、Klf4、OCt4、c-Myc基因将脐带基质间充质细胞编程为多潜能干细胞
目的:探讨利用Sox2、Klf4、Oct4、c-Myc基因将脐带基质间充质细胞(UMC)编程为多潜能干细胞(iPS)的可能性.方法:原代分离培养UMC细胞,包装生产逆转录病毒感染UMC细胞,将感染后细胞接种到饲养层细胞培养,镜下观察细胞形态学变化.对编程后细胞进行碱性磷酸酶(AP)染色、检测细胞基因表达量和体內分化畸胎瘤实验.结果:获得原代UMC细胞,细胞被编程后形态类似于胚胎干细胞,细胞AP染色阳性,內源多能基因Oct4、Sox2、Nanog、Rcx1表达量增高,外源编程基因Sox2、Klf4、Oct4、c-Myc表达沉默,细胞体內分化为畸胎瘤.结论:利用Sox2、Klf4、Oct4、c-Myc基因能将UMC细胞编程为iPS细胞.
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Sox2、Klf4、Oct4、c-Myc基因编程脐带基质间充质细胞
目的 探讨利用Sox2、Klf4、Oct4、c-Myc基因将脐带基质间充质细胞(UMC)编程为多潜能干细胞(iPS).方法 原代分离培养UMC细胞,包装生产逆转录病毒感染细胞,将感染后细胞接种到饲养层细胞培养,镜下观察细胞形态学变化.对编程后细胞进行碱性磷酸酶(AP)染色、检测细胞内源多能基因表达量和体内分化畸胎瘤实验.结果 原代获得UMC细胞,被编程细胞形态类似于胚胎干细胞,AP染色阳性,内源多能基因Oct4、Sox2、Nanog、Rex1表达量增高,体内分化为畸胎瘤.结论 利用Sox2、Klf4、Oct4、c-Myc基因可将UMC细胞编程为iPS细胞.
