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HBx-GFP DN突变子长期稳定表达抑制2.2.15细胞乙型肝炎病毒基因的表达
目的探索和寻找更有效的乙型肝炎治疗新的靶点和新的治疗方法,研究其抗病毒基因表达作用.方法运用基因工程技术,建立了HBx-GFP及其作对照的表达野生X蛋白、绿色荧光蛋白(GFP)的长期稳定表达细胞克隆,Northern blot检测细胞内的乙型肝炎病毒相关基因RNA转录,应用RIA检测细胞上清液中HBsAg和HBeAg表达,观察对乙型肝炎病毒基因表达的影响.结果所构建的X-GFP突变子,Xwt,GFP质粒均能在2.2.15细胞株中稳定高效表达并使细胞上清液中HBsAg HBeAg表达水平分别较2.2.15组的(101±5.5)ng/ml、(121±8.6)ng/ml显著降低为平均(7.6±11.5)ng/ml、(35±3.5)ng/ml(P＜0.01),细胞内的病毒3.5kb,2.1kb及2.4kb的RNA与各对照组比较均有显著降低,以2.1kb及2.4kb的mRNA下降为显著.结论乙型肝炎X基因DN突变子X-GFP能显著抑制乙型肝炎病毒基因转录和S,C基因的表达.提示,X基因亦是乙型肝炎治疗的一个靶基因.
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pRevX-GFP DN突变体抑制HepG2 2.2.15细胞乙型肝炎病毒复制的实验研究
目的建立pRevX-GFP及其作对照的表达野生X蛋白、绿色荧光蛋白的长期稳定表达细胞克隆,进一步研究以乙型肝炎病毒(HBV)X基因作为治疗靶,运用DN突变体技术,进行抗HBV的稳定表达对抗HBV复制的作用. 方法运用基因工程技术,分别以逆转录病毒载体pRev TRE为载体,构建表达野生型HBV X蛋白,GFP蛋白和X与GFP融合的X-GFP融合蛋白的质粒,并分别导入乙型肝炎的转基因细胞株HepG2 2.2.15细胞(简称2.2.15细胞)中,并通过长期的潮霉素抗性选择,获得能稳定表达DN蛋白的2.2.15细胞克隆.应用dot blot检测细胞上清液及细胞中HBV DNA,Southern blot检测细胞内HBV复制中间体,以观察其表达对HBV病毒复制的影响. 结果所构建的pRevX-GFP突变体、pRev Xwt、pRev GFP质粒均能在2.2.15细胞株中稳定高效表达.pRevX-GFP高效表达后,能有效地抑制或阻断细胞内HBV核酸合成及其分泌入细胞上清液.定量聚合酶链反应结果显示,pRevX-GFP组的平均每毫升HBV DNA浓度较2.2.15细胞组分别下降1.0～1.8lg值,对细胞内外dot blot结果进行图像分析,其灰度值仅为对照2.2.15细胞组的7.9%,Southern blot分析则发现,X基因DN突变体对HBV复制中间体rcDNA、ssDNA及dsDNA的形成有全面抑制作用. 结论 pRevX-GFP DN突变体具有显著抑制HBV复制作用.初步证实X基因是HBV治疗的一个新靶点.针对X基因的治疗,有望为HBV治疗提供一些新的思路.
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HBX-GFP基因工程DN突变体瞬时表达及乙型肝炎病毒复制的实验研究
寻找有效的乙型肝炎病毒(HBV)的基因治疗方法,成为当前抗HBV感染的研究热点.新近出现的DN突变体技术(Dominant negative mutant)[1,2],显示出了良好的抗HBV作用苗头.
