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腺病毒介导的Akt/mTOR基因沉默抑制肾癌786-O细胞增殖并促进细胞凋亡
目的 应用腺病毒技术下调Akt/mTOR表达水平,检测Akt/mTOR基因沉默对人肾癌786-O细胞增殖和凋亡的影响.方法 收集人肾癌及癌旁样品,Real time PCR检测两组样品中Akt和mTOR的mRNA水平.利用病毒包装细胞293A获得靶向Akt/mTOR基因的重组腺病毒,感染人肾癌786-O细胞株.实验分2组:加入靶向Akt/mTOR基因的腺病毒感染的肾癌细胞组(rAd5-Am组),未处理的腺病毒感染的肾癌细胞组(NC组).应用Real time PCR及Western blot检测干扰前后Akt和mTOR mRNA及蛋白表达水平的变化.用细胞增殖及凋亡试剂盒检测Akt和mTOR沉默后,肾癌786-O细胞增殖、凋亡及PCNA表达水平的改变.结果 与癌旁组织相比,Akt和mTOR的mRNA水平在肾癌组织中分别上调了2.613和3.254倍.成功获得knock down Akt/mTOR的rAd5-Am腺病毒及对照腺病毒,感染肾癌786-O细胞.Real time PCR显示rAd5-Am组与NC组相比Akt/mTOR的mRNA水平分别下调65.3％和77.1％,Western blot结果显示rAd5-Am组与NC组相比Akt/mTOR的蛋白表达水平分别下调78.4％和89.2％.rAd5-Am能显著降低786-O细胞中Akt/mTOR基因的表达.细胞增殖与凋亡实验表明,Akt/mTOR基因沉默后能显著抑制肾癌细胞786-O的增殖,并促进其凋亡(rAd5-Am组细胞凋亡率是NC组的2.57倍).进一步的实验结果表明,Akt/mTOR下调后能降低PCNA的蛋白量,从而抑制肾癌细胞的增殖.rAd5-Am感染的肾癌786-O细胞的增殖和PCNA蛋白量受到抑制,而凋亡率增加.结论 构建出能稳定干扰Akt/mTOR基因表达的肾癌786-O细胞株.Akt/mTOR腺病毒干扰载体可有效沉默肾癌786-O细胞的内源性Akt/mTOR基因,抑制肾癌786-O细胞的增殖,下调PCNA的表达,并促进细胞凋亡.
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异泽兰黄素对肾癌786-O细胞增殖的抑制作用及分子机制
目的 探讨异泽兰黄素对肾癌786-O细胞增殖的影响及分子机制.方法 应用MTT法检测不同浓度(2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 mmol/L)异泽兰黄素对肾癌786-O细胞活力的影响,流式细胞仪检测异泽兰黄素对肾癌786-O细胞凋亡的影响,Transwell检测异泽兰黄素对肾癌786-O细胞侵袭的影响,荧光定量PCR检测异泽兰黄素对肾癌786-O细胞miR-21表达的影响.转染病毒构建miR-21稳定表达细胞株,MTT、流式细胞仪和Transwell分别检测miR-21和异泽兰黄素对肾癌786-O细胞增殖、凋亡和侵袭的影响,Western blot法检测miR-21和异泽兰黄素对细胞内p-AKT、AKT、Bax和Bcl2蛋白表达的影响.结果 2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 mmol/L异泽兰黄素作用肾癌786-O细胞,细胞活力显著降低,且呈现浓度依赖性.与正常对照组相比,异泽兰黄素作用细胞24 h能显著促进细胞凋亡(P＜0.01),抑制细胞侵袭(P＜0.01),抑制miR-21的表达(P＜0.01),且作用均具有浓度依赖性;Western blot结果显示,异泽兰黄素抑制AKT磷酸化水平和Bcl2蛋白表达,促进Bax蛋白表达,与正常对照组相比意义具有显著统计学差异.过表达miR-21能显著抑制异泽兰黄素诱导的细胞凋亡和侵袭,并抑制异泽兰黄素调控的p-AKT、Bax和Bcl2的表达.结论 异泽兰黄素可抑制肾癌786-O细胞miR-21的表达,通过激活AKT通路诱导细胞凋亡.
