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采用分子筛层析法分离纯化细粒棘球蚴囊液粗抗原
目的 分离纯化细粒棘球蚴囊液抗原,去除其中的非特异性反应蛋白,探索优化囊液抗原制备方法. 方法 采用超滤法浓缩羊肝细粒棘球蚴囊液制备成粗抗原,并采用免疫印迹实验对囊液抗原进行分析,发现非特异性反应的主要蛋白条带.随后采用Superdex凝胶柱通过分子筛层析法对囊液抗原进行纯化.用44份细粒棘球蚴病患者、17份健康人和10份囊尾蚴患者血清进行酶联免疫实验,评估纯化后囊液抗原的检测能力. 结果 免疫印迹实验发现,非特异性反应的主要条带的相对分子质量(Mr)约为55 000,纯化后去除了该非特异性反应蛋白.纯化后的囊液抗原ELISA检测灵敏度为93.2％ (41/44),特异性为94.1％ (16/17),约登指数为0.87,与囊尾蚴病交叉反应性为30％(3/10).未纯化前的灵敏度为90.9％ (40/44),特异性为88.2％ (15/17),约登指数0.79,与囊尾蚴病交叉反应性为60％ (6/10).纯化前后ELISA检测的灵敏度存在显著性差异. 结论 本研究采用分子筛层析法对羊源细粒棘球蚴的囊液抗原进行纯化,去除了引起非特异性反应的主要蛋白(Mr 55 000),为后续进行囊液抗原标准化、提高检测能力提供了依据.
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脑囊尾蚴病患者外周血免疫反应的分析:T细胞对虫体糖蛋白和囊液抗原的反应活性
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抗猪囊尾蚴IgG4抗体的特异性抗原筛选
将囊液抗原蛋白采用双向凝胶电泳分离,经考马斯亮蓝染色后用双向电泳图像分析软件分析蛋白点,以脑囊尾蚴病患者血清为一抗进行蛋白质印迹分析(Western blotting),选取阳性蛋白点进行质谱分析,获取肽质量指纹图谱,采用Mascot软件在NCBI中搜寻、比对,筛选出抗猪囊尾蚴IgG4特异性抗原.囊液抗原经双向电泳检测到(201±5)个蛋白斑点,相对分子质量(Mr)为10 000～170 000,等电点(pI)为3.0～10.0.Westernblotting分析显示,与患者血清中特异IgG4抗体结合的抗原以小分子量蛋白为主,从中筛选出51个(抗原)点进行质谱分析,其中有21个点峰值大于39.对比分析显示,高峰值点与10种囊尾蚴蛋白有关,其中为密切相关的为4种蛋白,按分值高低排序分别为Ts8B2、Ts8B3、10ku抗原和Sequence 3.
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双向电泳及免疫印记法对囊尾蚴囊液抗原的分析、纯化及鉴定
目的通过分析、纯化囊液抗原,筛选高免疫反应性和高特异性抗原组分,用于囊虫病免疫诊断. 方法用分辨率极高的双向电泳法对囊液抗原进行分离、纯化,并通过免疫印记,用囊虫病人血清、包虫病人血清和其它异源血清筛选特异性抗原组分,为建立新一代免疫学诊断方法奠定基础. 结果得到了等电点为9.4,分子量为14KD和16.6KD两组抗原组分,特异性达100%,并且仅被急性感染的囊虫病人血清识别,而不被囊虫完全钙化病人血清识别. 结论得到了高免疫反应性和高特异性的蛋白纯品,为囊虫病的免疫诊断奠定了基础.
