首页 > 文献资料
-
人NKG2A、CD94的基因克隆和真核共表达载体的构建
目的 构建真核共表达载体pNKG2A-IRES-CD94.方法 提取人外周血淋巴细胞总RNA,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增NKG2A、CD94基因,分别克隆pMD-NKG2A、pMD-CD94,对克隆基因进行DNA序列分析.pMD-CD94经XbaⅠ和Sal Ⅰ酶切,插入相应酶切的真核表达载体pIRES(多克隆位点B),NKG2A经XhoⅠ和Mlu Ⅰ酶切,插入相应酶切的pIRES-CD94(多克隆位点A).结果 扩增的DNA片段和预期的人NKG2A和CD94大小一致;DNA序列分析显示,克隆的基因序列和GenBank数据库中人NKG2A和CD94基因序列一致.酶谱分析显示,NKG2A和CD94正向插入表达载体pIRES.结论 成功构建了含人NKG2A和CD94的真核共表达质粒pNKG2A-IRES-CD94,为研究NKG2A和CD94基因的功能奠定了基础.
-
癌胚抗原与IL-2真核双表达质粒的构建及体外表达
目的:构建癌胚抗原(CEA) 与白细胞介素2(IL-2)的真核双表达质粒,并检测其在体外的表达.方法:利用分子生物学技术,将CEA基因片段和IL-2基因片段连接于真核双表达质粒pIRES中,测定序列后,用脂质体包裹转染细胞,采用ELISA双抗体夹心法检测CEA和IL-2的表达.结果:核酸序列测定证实本实验所构建的质粒正确,质粒上所接入的CEA和IL-2的碱基序列与标准序列的同源性分别为99.8%和99.9%.该双表达质粒在体外转染细胞内后可表达CEA和IL-2分子.结论:实验所构建的pIRES-CEA- IL-2双表达质粒能在体外同时表达CEA和IL-2分子,说明本质粒具有在细胞水平同时表达两种生物大分子的活性,这一结果为其以后在整体动物水平的实验研究奠定了基础.
-
tPA和VEGF165基因共表达质粒对人血管细胞增殖的影响和纤溶作用
目的:观察组织纤溶酶原激活物(tPA)和血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)基因共表达质粒在血管平滑肌细胞(VSMC)中的表达,并研究表达产物对血管内皮细胞(VEC)和VSMC增殖的影响和纤溶作用.方法:用脂质体转染法将tPA和VEGF165的共表达质粒pBudCE4.1/tPA-VEGF165转染VSMC,逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和酶联免疫吸附实验(ELISA)分别从mRNA水平和蛋白质水平检测tPA和VEGF165的表达;纤溶蛋白板法检测转染基因的VSMC培养基中tPA的纤溶活性;取转染pBudCE4.1/tPA-VEGF165质粒的VSMC培养基培养VEC和VSMC,用四甲基偶氮唑盐(MTT法)和流式细胞技术检测转基因VSMC的细胞培养基对VEC和VSMC增殖的影响.结果:pBudCE4.1/tPA-VEGF165转染VSMC后,RT-PCR和ELISA检测发现,tPA和VEGF165在mRNA和蛋白质水平均有表达;转基因培养基有明显促进纤溶和促VEC增殖作用,而对VSMC增殖无作用.结论:tPA和VEGF165基因共表达质粒pBudCE4.1/tPA-VEGF165能在VSMC表达有生物学活性的tPA和VEGF165,为tPA和VEGF165基因转染防治移植心脏内血管狭窄奠定了基础.
-
内部核糖体进入位点控制人癌胚抗原与共刺激分子 B7-1的表达
目的构建能在真核细胞内高效表达的 CEA/B7-1共表达核酸疫苗,为进一步研究癌胚抗原 (CEA)核苷酸疫苗、佐剂及它们的特异性抗肿瘤作用奠定基础.方法通过 RT PCR及基因重组技术获得 CEA的真核表达质粒 pIRES CEA,并利用酶切、连接等手段与共刺激分子 B7-1基因重组成通过内部核糖体进入位点连接的含有两个表达单元的真核共表达质粒 pIRES CEA/IL-2.结果全自动电化学法定量测定 CEA表达量为 (23.73± 0.26)ng/ml,流式细胞仪测 B7-1为 44.65%.结论 CEA/B7-1共表达载体在真核细胞中能高效表达 CEA和 B7-1.
-
重组共表达载体pSLC-IRES-IL-2的构建及在COS-7细胞中的表达
目的: 构建共表达质粒pSLC-IRES-IL-2,并在COS-7细胞中表达.方法: 根据人SLC和IL-2 cDNA的序列分别设计、合成引物,构建以内部核糖体进入位点(IRES)相连的SLC和IL-2基因的真核表达质粒pSLC-IRES-IL-2,用电穿孔法以共表达质粒转染COS-7细胞.用Western blot检测SLC和IL-2的表达.结果: Western blot检测表明,以重组共表达质粒pSLC-IRES-IL-2转染的COS-7细胞能表达SLC和IL-2,表达产物的Mr同预期的结果相一致.结论:成功地构建SLC和IL-2基因的共表达质粒,以其转染COS-7细胞后,能分泌性表达SLC和IL-2,为肿瘤基因治疗的研究提供一定途径.
-
pEBFP/FP6共表达质粒转染神经干细胞的实验研究
目的:将α2巨球蛋白cDNA片段(FP6)-增强型绿色荧光蛋白(pEBFP)共表达质粒pEBFP/FP6转染至神经干细胞(NSC)中,观察其对NSC生长、分化、增殖的影响.方法:培养NSC,采用脂质体转染方法将pEBFP/FP6共表达质粒转染进NSC中,利用其携带的绿色荧光和RT-PCR观测其转染情况.结果:经鉴定所培养的细胞是NSC,采用脂质体转染方法成功的将pEBFP/FP6双表达质粒转染进NSC.结论:脂质体转染能将pEBFP/FP6共表达质粒转染进NSC中,pEBFP/FP6基因对神经干细胞生长、分化、增殖无明确影响.
