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IkBa文献资料
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蝎素组分Ⅲ对Jurkat细胞NF-κB通路的调节作用
目的:研究蝎素组分Ⅲ(SVC-Ⅲ)对Jurkat细胞NF-kB通路的免疫调节作用.方法:不同浓度(0、0.1、1.0、10、100ns/mL)SVCⅢ刺激Jurkat细胞,利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测IKK1和IkBa mRNA表达变化;荧光素酶报告基因测定NF-kB活化情况.结果:低剂量的SVC-Ⅲ(0.1、1.0 ng/mL)对IKK1、IkBa及NF-kB有促进作用,浓度为1.0ng/mL促进作用强,中、高剂量SVC-Ⅲ(10ng/mL、100 ng/mL)对IKK1、IkBa及NF-kB则有抑制作用.结论:不同剂量的SVC-Ⅲ对NF-kB呈现活化或抑制作用,因此对T淋巴细胞中NF-kB通路的调节具有剂量依赖性.
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用重叠PCR策略构建抑制NF-κB活性的IKBA基因突变体
目的:用重叠PCR方法将IKBA基因三个碱基进行点突变A94G、G95C、T106G.方法:根据重叠PCR原理设计IKBA基因两条末端引物及A94G、G95C、T106G突变引物,从HUVEC细胞克隆IKBA基因,将其作为模板进行第一次PCR,将第一次PCR产物稀释10000~50000倍后作为模板,扩增突变体IKBAm,并克隆到pLVX-IRES-ZsGreen载体,用双酶切及DNA测序筛选阳性质粒.结果:从HUVEC细胞克隆的IKBA基因及其突变体IKBAm基因长度均为954 bp,编码317个氨基酸,与IKBA基因相比,突变体IKBAm基因3个位点发生突变94A→G,95G→C,106T→G,编码的32/36位氨基酸由Ser突变为Ala.结论:成功克隆人IKBA基因及其32/36 Ser→Ala突变体IKBAm.
