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松果菊苷通过调控GFRα1/AKT信号通路抑制MPP+诱导的多巴胺能细胞SH-SY5Y凋亡
目的 研究肉苁蓉提取物松果菊苷(echinacoside)对1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)诱导帕金森病模型SH-SY5Y细胞的保护机制.方法 SH-SY5Y细胞分别接受磷酸缓冲溶液(PBS)、MPP+和/或松果菊苷处理后,分析细胞生长情况,采用Western blot结合免疫荧光法分析各处理组细胞内胶质细胞源性神经营养因子家族受体α1 (GFRα1)及其下游抗凋亡AKT(蛋白激酶B)磷酸化及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)水平变化,并观察AKT抑制剂LY249002对松果菊苷对SH-SY5Y的保护功能的影响.结果 松果菊苷可以显著缓解MPP+诱导的SH-SY5Y细胞的凋亡[MPP+ vs MPP+/松果菊苷,(25.12±4.33)％ vs (5.13±1.51)％,P＜0.01].松果菊苷可以抑制MPP+下调SH-SY5Y细胞内GFRα1表达和AKT磷酸化.进一步的研究表明特异性阻断AKT信号通路可以取消松果菊苷促进SH-SY5Y在MPP+诱导损伤下生存的功能,但不影响松果菊苷提高GFRα1的表达.对SH-SY5Y细胞内Caspase-3活性分析的结果显示,松果菊苷可以抑制MPP+诱导Caspase-3的活化[MPP+ vs MPP+/松果菊苷, (7.22±1.51) vs(1.81士0.42),P＜0.01],但是这一作用可以被AKT抑制剂阻断.结论 松果菊苷通过上调GFRα1/AKT通路抑制MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡,发挥保护神经细胞存活的功能.
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胶质细胞源性神经营养因子受体α1定点突变体制备及其稳定转染细胞株的构建及鉴定
目的:制备胶质细胞源性神经营养因子受体α1(GFRα1)的突变体质粒,并建立rGFRα1各突变体和RET基因双转染的稳定RCE细胞株.方法:通过Fugene6脂质体转染试剂,将PCR法快速制备的pcDNA3-rGFRα1突变体质粒分别与带潮霉素B抗性筛选标记的pcDNA3.1-RET质粒共转染野生型PC12细胞,建立rGFRα1各突变体和RET基因双转染的稳定PC12细胞株.经Western印迹和细胞免疫荧光化学方法对转染入PC12细胞中的各rGFRα1突变体基因和RET基因的表达进行鉴定.结果:Western印迹和细胞免疫荧光化学方法检测均证实了所构建的细胞株中有转入基因的正确表达.结论:成功构建了rGFRα1各突变体基因和RET基因同时转入表达的稳定细胞株,为研究rGFRα1中关键氨基酸的位点参与胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)信号转导的作用奠定基础.
