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利用同源片段交换提高腈水合酶的热稳定性
目的 通过计算机辅助半理性设计对热不稳定的恶臭假单胞菌Psedomonas putida NRRL-18668腈水合酶(EC4.2.1.84,nitrile hydratase,简称NHase)分子进行改造,提高酶催化的热稳定性和活性.方法 以嗜热假诺卡菌Pseudonocardia thermophila JCM3095和睾丸酮丛毛单胞菌Comamonas testosterone 5-MGAM-4DNHase作为模板,利用位点靶向氨基酸重组(site-targeted amino acid recombination,STAR)软件和分子动力学模拟分析选择合适的同源靶片段,通过同源交换替换Pseudomonas putida NRRL-18668NHase相应的片段,构建7株分别含有3种不同来源片段的新型杂合NHase,检测其热稳定性及活性;圆二色光谱分析野生酶和杂合酶3AB的二级结构.结果 7株杂合NHase (1A、2B、2C、2BC、3AB、3AC、3ABC)经50℃热处理10 min后,与野生型NHase相比,热稳定性分别提高了1.5～3.5倍,其中杂合NHase 3AB的热稳定性提高了3.5倍,酶活力提高了1.4倍;野生酶和杂合酶3AB二级结构中α螺旋含量分别为(34.56±3.21)％和(36.88±1.41)％,,β折叠含量分别为(19.78±3.21)％和(18.69±1.74)％.结论 通过利用热稳定性的同源片段来替换相应的热不稳定结构域这种理性设计的方法,成功将不耐热的NHase改造成耐热杂合NHase,同时提高了酶的比活力,并能维持NHase分子的基本二级结构不改变.
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杂合酶的研究现状与发展前景
近年来,随着人们对环境和能源问题的关注,以酶为催化剂的绿色生物催化技术越来越受到重视,而酶的催化能力是影响酶能否进行工业化应用的重要因素,同时,因催化不同反应的需要,新酶开发显得十分迫切.杂合酶技术是基于已有酶资源来进行新酶的设计和开发的技术,其具有独特的优点,尤其是目前酶的表达克隆、分子筛选、人工进化、DNA序列改组和体外突变等技术已成为常规技术,为杂合酶的开发及生产奠定了基础.本文对杂合酶的构建策略、构建方法及发展前景作一综述,为其应用和开发提供参考.
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重组超氧化物歧化酶1/3杂合酶在大肠杆菌中表达的优化
目的 获取活性高的重组SOD 1/3杂合酶.方法 用含pET-SOD 1/3的工程菌诱导表达重组SOD 1/3杂合酶,通过分析SDS-PAGE及SOD酶活性,考察诱导温度、诱导时间、诱导剂浓度,Cu2,Zn2浓度对重组酶表达量和活性的影响.结果 正交试验表明,用1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在A600=1.2时诱导,Cu2,Zn2浓度分别为2.4 mmol/L,诱导温度15℃,诱导时间12 h,能获得高活性重组SOD 1/3,其比活性为1 681 U/mg.结论 培养温度和Cu2、Zn2浓度是优化表达的主要因素.降低诱导温度有利于重组酶的可溶性表达,添加Cu2、Zn2能促进重组酶活性提高.
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青霉素G酰化酶的亚基重组
青霉素G酰化酶在半合成β-内酰胺类抗生素工业中催化关键反应.将来源于Esherichia coli的α亚基分别与Kluyvera citrophila,Providencia rettgeri,Alcaligenes faecalis的β亚基重组得到三种杂合酶,杂合酶表达量随野生型PGA同源性的减小而降低,E.coli和A.Iaecalis氨基酸序列的相同性低至41%,其杂合酶仍然具有水解3-苯乙酰胺-6-硝基苯甲酸的活力.
