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人腺苷甲硫氨酸脱羧酶的原核表达及纯化
目的 克隆人腺苷甲硫氨酸脱羧酶(S-adenosylmethionine decarboxylase,AdoMetDC )cDNA,原核表达并纯化重组AdoMetDC蛋白.方法 采用巢式RT-PCR法从人宫颈癌HeLa细胞株总RNA中克隆人AdoMetDC cDNA,插入载体pET-15b中,构建原核表达质粒pET- 15b/AdoMetDC,转化大肠杆菌Rossetta (DE3),IPTG诱导表达.表达的重组蛋白在尿素变性条件下 经Ni-NTA树脂亲和层析纯化,SDS-PAGE和Western blot法鉴定纯化的重组AdoMetDC蛋白.结果 克隆出编码全长人AdoMetDC的cDNA序列,并构建了重组原核表达质粒pET-15b/AdoMetDC；表达的重组AdoMetDC蛋白经SDS-PAGE分析,分别可见相对分子质量约35 000、30 000、14 000的前酶、自催化分裂后的α亚单位和β亚单位；前酶和β亚单位可被Ni-NTA树脂有效纯化；纯化的重组蛋白可被抗His抗体和抗AdoMetDC抗体特异性识别.结论 原核表达并纯化了人AdoMetDC,为其功能研究和临床应用奠定了基础.
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AMD1在胃癌中的表达及其与临床病理特征的关联
背景:S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶1(AMD1)是调控多胺代谢的限速酶,多胺代谢异常可引起细胞恶性转化.目前多胺代谢已成为近年肿瘤领域的研究热点.目的:探讨AMD1在胃癌中的表达及其与临床病理特征的相关性.方法:采用免疫组化法检测72例胃癌及其癌旁组织中的AMD1表达,并分析其与胃癌临床病理特征的相关性.培养胃癌细胞MGC803,以AMD1-siRNA和AMD1抑制剂MGBG分别干预胃癌细胞,CCK-8法检测胃癌细胞增殖情况.结果:AMD1在65.3%的胃癌组织中高表达,其表达与肿瘤直径、肿瘤浸润深度密切相关(P＜0.05),而与患者性别、年龄、TNM分期、淋巴结转移和远处转移无明显相关性(P＞0.05).以AMD1-siRNA和MGBG干预胃癌细胞后,细胞增殖力均明显下降(P＜0.05).结论:AMD1在胃癌中的表达升高,与肿瘤直径和肿瘤浸润深度密切相关;AMD1通过影响细胞增殖而参与胃癌的发生,有望成为胃癌诊断和治疗的新靶点.
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miR Let-7a1/f1下调前列腺癌1LNCaP细胞中AMD1蛋白的表达
目的 研究let-7a1/f1在前列腺癌LNCaP细胞中对S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(AMD1)表达的影响及作用机制.方法 以LNCaP细胞总RNA为模板,RT-PCR扩增let-7a1/f1基因的前体序列,将其克隆到pSilencerTM4.1-CMV neo载体中,构建成let-7a1/f1真核表达载体pSilencer-let7a1/f1.瞬时转染LNCaP细胞后,通过RT-PCR法,检测let-7a1/f1在转录水平的表达,同时通过RT-PCR及Western blot检测AMD1在转录和翻译水平的表达变化.构建AMD1基因3'非翻译区(3'-UTR)荧光素酶报告基因融合质粒(pMIR-AMD1),并与pSilencer-let7a1/f1共转染LNCaP细胞,通过双荧光素酶活性检测,确定let-7a1/f1对AMD1 3'-UTR的作用.结果 pSilencer-let7a1/f1和pMIR-AMD1经酶切电泳及测序鉴定正确,pSilencer-let7 a1/f1转染LNCaP细胞后,let-7a1/f1表达明显上升,AMD1在转录水平无变化,在翻译水平明显下降,let-7a1/f1转染后,pMIR-AMD1的荧光素酶活性明显降低.结论 miR Let-7a1/f1可作用于AMD1 3'-UTR靶点,抑制AMD1蛋白的翻译,从而降低LNCap细胞中AMD1蛋白的水平.
关键词： miR Let-7a1/f1 前列腺肿瘤 腺苷甲硫氨酸脱羧酶
